La chaya o árbol de la espinaca (Cnidoscolus aconitifolius spp. aconitifolius, Euphorbiaceae; syn. Cnidoscolus chayamansa) o el ‘chicasquil’ como se le conoce en Costa Rica, es un arbusto mesoamericano, probablemente originario del sur de México y Guatemala, y distribuido desde el sur de Texas hasta Sudamérica. Fue introducido a las islas del Caribe y de ahí a Florida, África tropical, Asia y Oceanía. La chaya ha sido cultivada desde tiempos prehispánicos y se usa para la medicina tradicional, en la cocina indígena y tradicional de varios países, incluido Costa Rica (Ebel et al., 2019; Ross-Ibarra and Molina-Cruz, 2002).

Al menos cuatro variedades cultivadas (‘Chayamansa’, ‘Redonda’, ‘Estrella’ y ‘Picuda’) son reconocidas en Yucatán y Guatemala, además de las formas silvestres de la especie. La planta se propaga de forma clonal mediante esquejes de tallo, ya que estas variedades producen pocas o ninguna semilla (Ebel et al., 2019; RossIbarra and Molina-Cruz, 2002). En Costa Rica, Hammel et al. (2010) mencionaron que se cultivan al menos dos variedades, la más común y distribuida se llama ‘Chicasquil’ y parece corresponder con la variedad ‘Picuda’, mientras que la variedad ‘Redonda’ es muy rara y se encuentra principalmente en la región de Baja Talamanca, donde se conoce como chaya entre las comunidades indígenas.

En marzo de 2020, se observaron síntomas de mosaico es un nuevo crecimiento de un esqueje plantado de chaya (muestra 20.222, Cuadro 1) en un traspatio en

Cuadro 1

Código de muestras	Cantón, Provincia	Fecha de recolecta	Variedad	Síntomas	RT-PCRx
20.222	Moravia, San José	4/2020	Estrella	Mosaico	Positivoy
20.439z	Montes de Oca, San José	11/2020	Picuda	No	Negativo
20.451	Pococí, Limón	11/2020	Estrella	No	Negativo
21.030z	Vázquez de Coronado, San José	02/2021	Chayamansa	No	Negativo
21.031z	Alajuela, Alajuela	02/2021	Picuda	No	Negativo

xRetro-transcripción-Reacción en Cadena de la Polimerasa con el par de iniciadores Potex4/Potex5 (Miglino et al., 2006).

Moravia, San José (9.964091, -84.041644). Los esquejes fueron un regalo de familiares y amigos indicando que era “chaya, un árbol medicinal del sur de México”. A medida que la planta se desarrollaba, un mosaico verde claro/verde oscuro fue notorio en todas las hojas (Figura 1a, b). La planta se parece a la chaya (chicasquil), pero la morfología foliar presentaba algunas diferencias. No existe una tradición de reconocimiento de variedades de chaya en Costa Rica, y encontramos discrepancias en las ilustraciones para las variedades entre Ebel et al. (2019), Ross-Ibarra y Molina-Cruz (2002), especialmente la var. ‘Chayamansa’. Así, nuestra identificación de las variedades es tentativa, con base en las descripciones e ilustraciones de los autores. La planta sintomática parece ser la var. ‘Estrella’ (poco común en Costa Rica). Se conjeturó que los síntomas observados corresponden a una infección viral, por lo que el objetivo de este trabajo fue verificar la naturaleza viral de la enfermedad de la planta e identificar la especie del virus.

Para probar la hipótesis de una presunta infección viral, esquejes de la planta sintomática fueron sembrados en recipientes plástico para vivero #3000 (volume

Figura 1

3 galones) usando suelo del sitio de recolección. La planta (20.222) se conserva en LaFOV-CIBCM (Universidad de Costa Rica, San Pedro, San José), invernadero A (casa con malla a prueba de áfidos con techo de policarbonato).

Para las pruebas de transmisión a otros hospederos, se trituró tejido foliar fresco de la chaya sintomática, en un buffer de fosfato de potasio (0.05M, pH 7.0) y se inoculó frotando un hisopo húmedo con el extracto de la hoja en la segunda y tercera hoja más jóvenes (de arriba hacia abajo) de 12 plantas de Nicotiana benthamiana rociadas previamente con carborundum. Las plantas de N. benthamiana tenían alrededor de dos meses de edad desde su germinación, se conservaron en el invernadero B LaFOV-CIBCM, en recipientes plásticos de vivero #100 con suelo esterilizado con vapor. Además, se inocularon 12 plantas sólo con amortiguador de fosfatos como controles. Las plantas fueron evaluadas una vez cada siete días, después de la inoculación (ddi). Un trozo del mismo tejido sintomático de chaya fue fijado con solución de Karnovsky en 0.05 M de buffer de cacodilato pH 7 a 6 8 °C y posteriormente fue procesado para microscopia electrónica de transmisión (TEM, por sus siglas en inglés) siguiendo protocolos previamente descritos (Montero-Astúa et al., 2008).

Se extrajeron los ácidos ribonucléicos totales (ARN) de la chaya (muestra 20.222) y de la N. benthamiana (i20.222-Nb) sintomática, siguiendo el protocolo del RNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, Alemania). Se obtuvo cDNA por retrotranscripción con el Maxima H minus first strand cDNA kit (Thermo Scientific, Lituania), siguiendo el protocolo del fabricante. Se analizaron las cADN para detectar la presencia del género Potexvirus con iniciadores degenerados específicos del género viral, Potex4 (5’-AGCATGGCGCCATCTTGTGACTG-3’) /Potex5 (5’-CTGA-AGTCACAATGGGTGAAGAA-3’), que amplifican 280 bp (Miglino et al., 2006) en un volumen de reacción final de 25 µL, con 2 µL de la cADN, 1X DreamTaq PCR Master Mix (Thermo Scientific, Lituania), y 200 nM de cada iniciador. Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador (MJMini, Bio-Rad, Singapore) con las siguientes condiciones: 94 ºC x 2 min; 45 ciclos (94 ºC x 30 s; 60 ºC x 1 min; 68 ºC x 1 min); 72 °C x 10 min. Además, se prepararon reacciones de PCR con pares de iniciadores para potexvirus (5’-TCAGTRTTDGCRTCRAARGT-3’) / Potex5V (5’-CAYCARCARGCMAARGAYGA-3’) o Potex2RC (5’-AGCATRGCNSCRT-CYTG-3’) / Potex5V; para los cuales los amplicones esperados son de 735 bp y 584 bp, respectivamente (van der Vlugt y Berendsen, 2002) con las mismas condiciones de PCR antes mencionadas y con el perfil térmico 95 °C x 5 min; 35 x (92 °C x 30 s; 51.5 °C x 30 seg; 72 °C x 10 min); 72 °C x 10 min. Se incluyeron controles negativos (mezcla de reacción PCR sin cADN, reemplazado con agua) en todas las PCR corridas, se emplearon como controles positivos ARN de tejido foliar infectado con los potexvirus Plantago asiatica mosaic virus (PlAMV) y Cymbidium mosaic virus (CymMV) de la colección CIBCM-UCR (Montero-Astúa et al., 2017).

Los productos de la amplificación se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % con buffer 1X TAE (40 mM Tris base, 20 mM ácido acético glacial y 1 mM EDTA) a 90 voltios, empleando GelRed® (10000X en agua, Biotium, USA) como agente de tinción de ácido nucleico, en un buffer de carga de muestra (TriTrack DNA Loading Buffer 6X, Thermo Scientific, Lituania) y se observó en un transluminador de luz ultravioleta (55W, BXT-26.M, Uvitec, Francia). Dos amplicones fueron enviados a Macrogen (Macrogen Inc., Corea del Sur) para su purificación y secuenciación (Sanger), en ambas direcciones, empleando los mismos pares de iniciadores usados para la amplificación. Las secuencias fueron editadas para la obtención de los contig en BioEdit (v.7.0.5.3). Se descargaron secuencias de CsCMV del GenBank y se realizó un análisis filogenético usando MEGA X (v.10.1.5) con el modelo estadístico de Máxima Verosimilitud, empleando el modelo de sustitución de nucleótidos Tamura-Nei (TN93) y modelando la no-uniformidad de las tasas evolutivas junto con una distribución gama discreta (+G). La prueba de la filogenia se realizó empleando un “bootstrap” de 2000 réplicas.

Después de identificar la presencia de un virus relacionado con los síntomas, se identificaron 13 plantas adicionales de chicasquil, en diferentes ubicaciones y se evaluaron de forma visual para síntomas de mosaico. Se tomaron muestras de cuatro de esas plantas (una hoja completamente expandida/ planta) para analizar más a fondo por medio de RT-PCR con los iniciadores Potex4/Potex5, como se describió anteriormente (Cuadro 1). Se realizaron postulados modificados de Koch para virus de plantas, para ello se sembraron esquejes de tallo de tres de esas plantas adicionales muestreadas y negativas para la presencia de potexvirus por RT-PCR (20.439, 21.030, 21.031, Cuadro 1) en macetas de plástico de viveros #400 con suelo esterilizado a vapor y conservados en el invernadero B LaFOV-CIBCM. Cuatro meses después de establecidas las plantas, éstas fueron inoculadas con la muestra 20.222, como se describió anteriormente. Además, un esqueje de cada planta madre fue inoculado con un buffer como control, en total 13 plantas de chicasquil fueron inoculadas con el virus y tres como control. Las plantas fueron evaluadas una vez cada 7 días hasta los 35 ddi. Se recolectó el tejido foliar de la chaya sintomática y se obtuvo una muestra compuesta según origen de los esquejes (n=3, 20.439, 21.030, 21.031). Las muestras se conservaron a -35 °C y evaluaron por RT-PCR con el par de iniciadores Potex5/Potex5 previamente descrito.

Se desarrolló un mosaico clorótico en tres plantas de N. benthamiana 28 días después de inoculación mecánica con la muestra 20.222. Una segunda inoculación se realizó para confirmar los síntomas, usando tejido de N. benthamiana como inóculo sintomático, obtenido de la inoculación anterior; y tres de cuatro N. benthamiana presentaron en el follaje un mosaico clorótico severo y ampollas a los 28 ddi (Figure 1c).

En secciones ultrafinas obtenidas del tejido foliar de la chaya sintomática (20.222), se observaron por TEM, cloroplastos que perdieron la forma lenticular típica, alteración o ausencia de tilacoides, así como una creciente presencia de gránulos osmiofílicos (Figura 2). Estas alteraciones son similares a las descritas para CsCMV en yuca por Zanini et al. (2021). No se observaron partículas o agregados (rueda de molino) asociados a potyvirus, partículas isométricas (como los cucumovirus), bacilliformes (badnavirus) o en forma de bala (rhabdovirus de plantas). Los núcleos presentaron una apariencia regular, sin inclusiones ni partículas virales. Se

Figura 2

observaron inclusiones bandeadas en la muestra (Figura 2), semejantes a las reportadas para los potexvirus y a las reportadas para CsCMV en chaya (Zettler Elliott, 1986) y yuca (Zanini et al., 2014).

La chaya (20.222) y tejido sintomático de N. benthamiana inoculadas (iNb20.222) dieron positivo a potexvirus mediante RT-PCR con varios iniciadores degenerados para el género viral. La secuenciación de los amplicones obtenidos de la muestra de chaya (20.222) y de N. benthamiana (iNb-20.222) produjo secuencias parciales correspondientes al virus del mosaico común de la yuca (CsCMV), lo cual resultó en la identificación del mismo patógeno viral, tanto en chaya (muestra 20.222) como en la N. benthamina inoculada sintomática (iNb-20.222). Las secuencias obtenidas de los amplicones con diferentes pares de iniciadores se superpusieron, se obtuvo una secuencia final para la muestra sintomática de chaya (20.222) y se depositó en el GenBank, (Número de Acceso OK642586). El árbol filogenético generado al comparar la secuencia obtenida en este estudio y varias para CsCMV disponibles del GenBank demostró que la secuencia de chaya de Costa Rica agrupa en un clúster independiente con secuencias de CsCMV-chaya de Venezuela (Mejías et al., 2015) y separadas de secuencias de CsCMV de yuca, incluyendo a la reportada como proveniente de Costa Rica (Lozano et al., 2017) (Figura 3).

Se buscaron síntomas de mosaico en varios sitios, con un total de 13 arbustos de chaya evaluados de forma visual, además de la muestra sintomática (20.222) que inicio este estudio. No se observaron síntomas como en la muestra 20.222 (Cuadro 1). Cuatro muestras adicionales seleccionadas dieron negativo para potexvirus por RT-PCR (Cuadro 1).

Solo tres plantas (tentativa var. ‘Chayamansa’ originaria de la muestra 21.030) presentaron síntomas de mosaico 21 ddi y se confirmó su infección con CsCMV por RT-PCR de un total de 13 plantas de chaya inoculadas con la muestra 20.222. No se presentaron síntomas a los 35 ddi en ninguno de los 4/4 arbustos de la var. ‘Picuda’ propagados por esquejes a partir de cada una de las muestras 20.439 y 21.031, respectivamente. Así, se cumplieron los postulados modificados de Koch, y se demostró la patogenicidad del virus en la chaya. Asimismo, se observó una reacción diferencial entre las variedades: la var. ‘Picuda’ costarricense parece resistente.

El virus del mosaico común de la yuca (CsCMV, por sus siglas en inglés) es un miembro de los Potexvirus, Alphaflexiviridae, que infecta a la yuca y otros hospedantes en varios países de Sudamérica, como Brasil, Colombia, Paraguay, Perú y Argentina (Costa y Kitajima, 1972; Di Feo et al., 2015; Fernandez et al., 2017; Tascon et al., 1975), así como en China (Tuo et al., 2020). El virus se transmite mediante la reproducción asexual del tejido vegetal y no se conoce ningún vector (Costa y Kitajima, 1972). En la actualidad, se considera un patógeno re-emergente

Figura 3

en Argentina (Zanini et al., 2018), mientras que en Colombia no se asocia con una alta incidencia o impacto económico (Lozano et al., 2017).

Una cepa de CsCMV se reportó inicialmente en chaya (CsCMV-Ch) en Florida (EE.UU.) y Yucatán (México). La cepa CsCMV-Ch tiene relación serológica, aunque es diferente de las cepas que infectan la yuca sudamericana (Elliott y Zettler, 1987; Zettler y Elliott, 1986). A la fecha, se ha reportado infecciones de CsCMV en chaya de Florida (por material vegetal introducido de Puerto Rico, Zettler y Elliott, 1986), México (Elliott y Zettler, 1987), Tuvalu (Jones et al., 1998) y Venezuela (Mejías et al., 2015).

La presencia del CsCMV en yuca en Costa Rica no ha sido confirmada, no existen reportes oficiales, ni se han encontrado publicaciones locales, tesis o boletines con resultados de su detección. Asimismo, ni la base de datos global de EPPO (https://gd.eppo.int/) ni el compendio CABI (https://www.cabidigitallibrary.org/ doi/10.1079/cabicompendium) incluyen a Costa Rica en la distribución geográfica de este virus. Existe una secuencia de CsCMV reportada de un acceso costarricense de yuca (ver tabla suplementaria 1 en Lozano et al., 2017), la cual fue obtenida de material recolectado en el 2012 y conservado in vitro en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Colombia). Se sugiere la necesidad de confirmar la actual presencia del virus en Costa Rica in situ, así como en el caso de Argentina (Di Feo et al., 2015).

Consideramos pertinente, poner más atención al hallazgo aquí informado: i) la diversidad de cepas CsCMV, ii) transmisión mecánica eficiente, iii) re-emergencia de la enfermedad en Sudamérica, iv) la capacidad de causar enfermedades sin la presencia de otros virus de la yuca, v) el cambio climático que puede alterar la interacción virus-planta, dado que vi) la yuca es un alimento de subsistencia y básico en diferentes regiones (Lozano et al., 2017; Venturini et al., 2016; Zanini et al., 2014, 2018).

La detección de CsCMV aquí reportada no es una confirmación de la presencia de la enfermedad del mosaico común de la yuca (CCMD) en Costa Rica, ya que el análisis filogenético con las únicas secuencias parciales del virus de la chaya (Costa Rica y Venezuela) se agruparon de forma independiente a los aislados del virus que afecta a la yuca. Investigadores venezolanos realizaron muestreos en algunos estados de Venezuela y no detectaron el CsCMV en plantas de yuca (ChaparroMartínez y Trujillo-Pinto, 2003), sin embargo, la cepa de la chaya se reportó en Venezuela (Mejías et al., 2015). Nuestra hipótesis es que la infección aquí reportada, es una introducción independiente de la cepa de chaya de CsCMV (CsCMV-Ch) y quizá reciente en Costa Rica porque i) el nombre de chaya no es ampliamente usado en el Valle Central de Costa Rica; ii) la variedad ‘Estrella’ es desconocida en el país; iii) los esquejes compartidos como “la chaya, un árbol medicinal del sur de México” indica algo extranjero o nuevo, no relacionado con el arbusto comestible ‘chicasquil’; y iv) el análisis filogenético obtenido sugirió una cepa diferente en comparación con secuencias de CsCMV que infecta a la yuca (Figura 3).

La detección de CsCMV en un arbusto de chaya en Costa Rica es un ejemplo de la facilidad para propagar virus mediante la propagación vegetativa, y llama la atención sobre factores importantes que considerar; saber, i) un alto riesgo de introducción a nuevas regiones y países en plantas propagadas de forma vegetativa, debido al movimiento humano, factores socioeconómicos y tradiciones culturales. En este caso, el uso de plantas medicinales y la tradición de compartir esquejes y semillas, entre familias y amigos ayuda a propagar y diseminar las plantas y sus enfermedades. Las especulaciones económicas o las demandas de los consumidores pueden exigir a los productores que intercambien material vegetal entre regiones de un país, o incluso entre países sin una vigilancia fitosanitaria, como fue el caso mencionado para la yuca en el norte de Argentina (Zanini et al., 2018), así como para la uchuva (Physalis peruviana) y varios Passiflora spp. en Colombia (Rodríguez et al., 2016). ii) En consecuencia, el problema fitopatológico requiere de un enfoque transdisciplinario con la participación de fitopatólogos, biólogos, sociólogos, políticos y comunicadores sociales, entre otras disciplinas. iii) Desde otra perspectiva, las tradiciones locales y los recursos genéticos tradicionales de una región en particular podrían estar en riesgo debido a fitopatógenos introducidos, a los cuales las plantas locales, un reservorio genético, son ajenas al virus.

Los hallazgos confirman la presencia de un virus relacionado al CsCMV, previamente no informado para Costa Rica, en Cnidoscolus aconitifolius. A la vez se generan nuevas interrogantes e hipótesis que apuntan a la necesidad de probar la susceptibilidad de diferentes variedades de C. aconitifolius a CsCMV-Ch y amerita mayores estudios de la ocurrencia de CsCMV en yuca en Costa Rica.