rmfi Revista mexicana de fitopatología Rev. mex. fitopatol 0185-3309 2007-8080 Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C. 10.18781/R.MEX.FIT.2211-1 Nota Fitopatológica Etiología de la pudrición del rizoma del espárrago (Asparagus officinalis) en Atenco, Estado de México Gonzalez-Cruces*, Juan Agustin 1 Sandoval-Islas, José Sergio 1 Nava-Díaz, Cristian 1 SandovalSánchez, Maricarmen 1 Colegio de Postgraduados, Km 36.5 Carretera México-Texcoco, Montecillo, Texcoco, Estado México, CP 56230, México. Colegio de Postgraduados Colegio de Postgraduados Texcoco Estado México 56230 Mexico Autor de correspondencia: Juan Agustin Gonzalez-Cruces. gonzalez.agustin@colpos.mx 04 10 2024 Jan-Apr 2024 42 1 RMEXFIT2211-1 30 11 2022 20 10 2023 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons Resumen

Objetivo/antecedentes. El objetivo de esta investigación fue identificar el agente causal de la pudrición del rizoma del espárrago, así como evaluar distintos métodos de inoculación y la severidad de los aislados.

Materiales y métodos. El muestreo se realizó en cinco parcelas productoras Atenco, Edo. de México. Se seleccionaron cinco aislados de Fusarium spp. (una por parcela) para realizar las pruebas de patogenicidad. Se seleccionaron tres aislados por sus características de colonización para las pruebas de severidad con diferentes métodos de inoculación: Inmersión por 12 h, inmersión por 30 min e inoculación por contacto de papel absorbente embebido en 1 mL de inóculo. Se emplearon concentraciones de 1x106 de conidios mL-1. Se utilizaron 10 rizomas por tratamiento y 10 rizomas sin inocular. Para determinar la severidad, se analizaron fotografías (en GIMP®) del rizoma a los siete días después de la inoculación. Los aislados se identificaron molecularmente con ITS4/ITS5, EF688/EF1521 y TUBT1/BT2B.

Resultados. Se identificó morfológica y molecularmente a Fusarium prolifetatum en los tres aislados. El aislado P3DR fue el más severo (14.6%), seguido de P5DR (13.9%) y P1SIR (11.6%).

Conclusión. El método de inoculación más efectivo fue el de inmersión por 30 min. Se registraron en el Banco de Genes del NCBI con accesiones ON738484 (P3DR), ON973801 (P5DR) y ON738483 (P1SIR). Este es el primer reporte de F. prolifetatum en el Edo. de México.

 Palabras clave: Fusarium proliferatum espárrago severidad inoculación. Introducción

El espárrago (Asparagus officinalis) es una hortaliza que tiene su centro de origen desde Europa Del Este, Cáucaso y Siberia (Faostat, 2019). Sin embargo, en México, es una hortaliza captadora de divisas, ya que casi el 90 % de la producción se exporta a Estados Unidos de Norteamérica y Europa. El valor económico de la producción nacional en el 2018 ascendió a 7,723 millones de pesos, al producirse 206,225 t (SIAP, 2020). Sonora (129,808 t), Guanajuato (27,146 t), Baja California (27,070 t), Baja California Sur (16,917 t) y Querétaro (5,284 t) son los principales productores de esta hortaliza y concentran el 99% de la oferta de exportación nacional (SIAP, 2022).

El espárrago es una planta perenne, diploide monocotiledónea, cuya parte comercial son los turiones que se desarrollan de yemas situadas en la parte apical del rizoma (Moreno-Pinel et al., 2021). Una vez que los turiones alcanzan una longitud comercial se cortan con una cuchilla, haciendo una incisión entre la base del turión y el rizoma generando heridas en la planta con vulnerabilidad de entrada de patógenos (Moreno-Pinel et al., 2021). Dentro del género Asparagus sólo esta especie es de importancia económica (Faostat, 2019).

A pesar de su importancia, el cultivo es afectado en todas sus etapas fenológicas por la pudrición del rizoma causado por especies del género Fusarium. La incidencia de este patógeno se refleja en el desarrollo de turiones (Quilambaqui et al., 2004). Fusarium proliferatum es la especie de mayor importancia que se ha reportado como patógeno de presencia mundial y su importancia radica en la severidad con la que ataca el rizoma de genotipos susceptibles (Elmer, 1996; Moreno-Pinel et al., 2021). Adicionalmente, Fusarium spp. se ha reportado como productor de toxinas presentes en turiones comercializables de espárrago. La presencia de estas toxinas de tipo Fumonisinas B1, B2 y B3 suponen un riesgo para la salud humana presente en turiones producidos en plantas enfermas (Seefelder et al., 2002; Liu et al., 2007).

En el núcleo ejidal del municipio de Atenco, Edo. de México, el cultivo de espárrago ha tomado gran auge debido a su rentabilidad y adaptación a las condiciones edafoclimáticas de la zona. Actualmente, el cultivo se distribuye en 20 hectáreas, todas ellas con diferentes edades de plantación, niveles tecnológicos y manejo; sin embargo, en todas las zonas productoras se han presentado problemas de pudrición del rizoma derivando en pérdidas económicas directas a los productores. Atenco es una región con posibilidad de expandir el cultivo de espárrago y debido al incremento de la incidencia de esta enfermedad, se planteó el presente trabajo con el objetivo de identificar el agente causal de la pudrición del rizoma del espárrago, evaluar la patogenicidad con distintos métodos de inoculación y evaluar la severidad de los aislados obtenidos.

Colecta de tejido vegetal. Se realizó un muestreo dirigido a cinco plantas por parcela (cinco parcelas) que presentaban síntomas de declinamiento, marchitez y amarillamiento en etapa fenológica de floración-fructificación ubicadas en el municipio de Atenco, Edo. de México. La colecta se realizó con una pala desinfestada con alcohol al 70%, desenterrando parcialmente el rizoma y cortando de 5 a 10 cm de diámetro aproximadamente. Todos los sitios de muestreo tuvieron las mismas variables genotípicas y tecnificación baja. Se utilizó un navegador GPS portátil de la marca Garmin en Reach Explorer®, para georreferenciar cada punto de muestreo. Las muestras fueron etiquetadas, registradas con un I.D. (Cuadro 1), empacadas en bolsas de polipapel y transportadas en hielera para su procesamiento en un laboratorio de Fitosanidad Fitopatología, del Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, Edo. de México.

Parcelas de esparrago muestreadas con síntomas de declinamiento y marchitez con tecnología baja (riego por gravedad y sin acolchado), manejo agronómico no orgánico y etapa fenológica floración-fructificación, en Atenco, Edo. de México.
I.D. Predio Coordenadas Edad (años) Genotipo
P1SIR San Indalecio 19° 33” 24´ N 98° 55” 54´W 3 Sulken
P2DR Diamante 19° 33” 01´ N 98° 56” 14´ W 5 Sulken
P3DR Diamante 19° 33” 02´ N 98° 56” 15´ W 6 Sulken
P4DR Diamante 19° 33” 03´ N 98° 56” 15´ W 6 Sulken
P5DR Diamante 19° 33” 10´ N 98° 56” 10´W 6 Sulken

Aislamiento y purificación. Los tejidos de rizoma se lavaron con agua desmineralizada estéril para eliminar exceso de suelo. Cada muestra de rizoma se cortó en trozos de 1 × 1 cm con un bisturí previamente desinfestado con la ayuda de un microscopio de la marca Iroscope® YZ-6. Posteriormente el tejido se desinfestó con hipoclorito de sodio al 1% durante 2 min; se lavó con agua desmineralizada estéril tres veces y se transfirió a cajas Petri con Papa-Dextrosa-Agar (PDA) Difco Laboratories®. Por cada planta (cinco plantas por parcela), se sembraron seis trozos de rizoma por caja. Las cajas Petri se incubaron durante dos días a 28 °C en una estufa de cultivo Riossa® Serie-33. Cuando se observó crecimiento micelial se procedió a purificarlos por el método de punta de hifa a cajas Petri nuevas con medio PDA. Del crecimiento micelial por punta de hifa se procedió a obtener cultivos monospóricos. Mediante el raspado con una aguja de disección curva se transfirió el crecimiento micelial de punta de hifa a un tubo Falcon de 50 mL con agua desmineralizada estéril, se agitó con Vortex WiseMix® y se contabilizaron los conidios con un hematocitómetro Neubauer. Posteriormente se realizaron diluciones hasta 1 × 106 conidios mL-1. De la última suspensión se tomaron 100 μL, los cuales se vertieron en una caja Petri con PDA y se distribuyó con un asa Digralsky estéril, se incubó a 28 °C, hasta observar crecimiento micelial individual para obtener crecimientos monospóricos.

Identificación morfológica. La identificación morfológica se realizó con ayuda de claves taxonómicas reportadas por Leslie y Summerell (2006) y Booth (1988). Los aislados se sembraron en medio de cultivo Clavel-Agar para la producción de macroconidios. Posteriormente, se realizaron preparaciones fijas para observarlas bajo el microscopio compuesto (Velab VE-B2 de 10x y 40x) integrado al Programa Motic Images Plus v2.0. Se determinó coloración micelial, así como la morfología y morfometría conidial en 60 conidios por aislado con edad de 7 días después de siembra.

Pruebas de patogenicidad. Las inoculaciones se realizaron en plántulas de espárrago del genotipo Sulken de tres meses de edad. Se inocularon cinco aislados de Fusarium spp. a una concentración de 1x106 conidios mL-1 con tres repeticiones por tratamiento. De cada aislado se tuvieron rizomas sin inocular (testigos). Se establecieron tres métodos de inoculación:

Inmersión en tubos de ensayo 1. Se sumergió la zona radical de las plántulas en tubos de ensayo con 50 mL de 1 × 106 de suspensión conidial durante 30 min. (Modificado de Farahani-Kofoet et al., 2020).

Inmersión en tubos de ensayo 2. Se realizó la misma metodología previamente mencionada, pero en un volumen de 10 mL de suspensión conidial y se introdujo el rizoma durante 12 h.

Inoculación mediante papel absorbente. Círculos de 5 mm de diámetro de papel filtro Whatman No. 4 se embebieron en una suspensión de conidios de 1 x 106 durante 2 min. Posteriormente, se procedió a colocar los círculos de papel filtro sobre la zona apical del rizoma sin herida.

Los rizomas se evaluaron a los 7 días después de la inoculación. Posteriormente, se observó la colonización en microscopio estereoscópico y se reaislaron solo tres aislados que por sus características de colonización se evaluaron para determinar severidad.

Evaluación de severidad. Se siguió la misma metodología de inoculación previamente mencionado, con 10 repeticiones por tratamiento y testigo. Se realizó un registro fotográfico de la zona más afectada de cada repetición. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Canon® (Réflex EOS REBEL T7 de 20.2 mp). Un total de 120 fotografías se procesaron en GIMP® v2.10, para cuantificar área total en pixeles (At) y área dañada (Ad) para determinar severidad. El porcentaje de severidad se obtuvo con la fórmula:

Los datos se analizaron mediante un ANOVA en el programa SAS 9.4 para determinar el aislado más severo y el método de inoculación más efectivo de acuerdo al análisis de medias por el método de LSD de Fisher (Abramoff et al., 2004).

Identificación molecular y análisis filogenético. Se realizó la extracción de ADN de tres aislados mediante la técnica de CTAB al 2% (Minas et al., 2011). Se determinó la concentración y pureza de los ácidos nucleicos por espectrofotometría con NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific 2000, EE. UU.). La confirmación de la especie se realizó molecularmente por PCR con los iniciadores ITS 4/ITS5, EF688/ EF1521 y TUB T1/BT2B (Cuadro 2) en un termociclador T-100 (BioRad) con un

Iniciadores utilizados, secuencia, región del gen amplificado, tamaño de amplicón y condiciones de PCR para identificación genómica de especies de Fusarium.
Iniciador Secuencia Región pb Condiciones PCR Referencia
ITS 4 ITS 5 5´-TCCTCCGCTTATTGATAT 5´-GGAAGTAAAAGTCGTAAC Región esparcidora interna transcrita rRNA 565 zID: 95 °C 4 min 35 cycles D: 95 °C 1min A: 58 °C 1min E: 72 °C 2min EF:72 °C 10 min White et al., 1990
FE688 FE1521 5´-CGGTCACTTGATCTACAA 5´-CCTCGAACTCACCAGTAC Factor de elogancia de traducción 1-α 650 ID: 95 °C 3 min 35 cycles D: 95 °C 35 s A: 59 °C 55s E: 72 °C 1:30 min EF:72 °C 10 min Alves et al., 2008
TUB T1 BT2B 5´AAYATGATIACIGGIGCIGCI 5´-ACCCTCAGTGTAGTGACC β-tubulina Proteína constitutiva 560 ID: 95 °C 5 min 35 cycles D: 95 °C 1 min A: 58 °C 1 min E: 72 °C 1:30 min EF:72 °C 5 min O’Donnell et al.,1998

z Desnaturalización inicial (DI), Desnaturalización (D), Alineamiento (A), Extensión (E) y Extensión final (EF).

volumen final de muestra de 15 µL integrada por: 7.86 µL de agua HPLC, 3 µL de 5X de buffer PCR, 0.6 µL de dNTP´s, 0.18 µL de los iniciadores (10 µM) (SigmaAldrich, EE. UU.), 3 µL de DNA genómico (20 ng) y 0.18 µL (2U) de GoTaq® ADN polimerasa (Promega, EE. UU.) (Cuadro 2). Los fragmentos amplificados se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1.5 % teñidos con bromuro de etidio y se visualizaron con luz UV en un fotodocumentador (UVP, Biolmaging Systems, Epi Chemi II Darkroom). Los productos de PCR se enviaron a secuenciar Macrogen®, Corea. Las secuencias se limpiaron y editaron con el programa BIOEDIT® para compararlos en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI).

Para el análisis filogenético se realizó una clasificación con el método UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic) utilizando los parámetros estándares de MEGA 1. Las secuencias de F. verticillioides (EU364864.1) y F. fujikuroi (CP023090.1) se seleccionaron como especies de referencia para la construcción del árbol filogenético.

Identificación morfológica. Los síntomas observados en campo fue una marchitez y amarillamiento generalizado (Figura 1 A-B). Al realizar un corte transversal de la parte basal del tallo se observó necrosis y taponamiento de haces vasculares (Figura 1 D-F). En todas las siembras de tejido del rizoma de las cinco parcelas, se observaron crecimiento similar, por lo que se seleccionó un aislado por predio. En medio PDA, los aislados P1SIR y P5DR fueron de crecimiento radial con tonalidades blanco amarillo en el anverso y tonalidades amarillo café en reverso. El aislado P3DR se observó micelio de tonalidad blanco con características algodonosas y crecimiento radial. A los 10 días después de la siembra en todos los aislados se visualizó la presencia de monofiálides y polifiálides, así como falsas cabezas o agregados de microconidios con base aplanada, de igual manera se observaron cadenas de microconidios y sin presencia de clamidosporas. Los macroconidios proliferaron en medio Clavel-Agar donde la morfometría fue de 26.47 µm x 4.43 µm (P1SIR), 25.97 x 4.92 µm (P3DR) y 26.21 µm x 4.76 µm de largo y ancho (P5DR). Todos los macroconidios presentaron célula apical curva y célula basal en forma de pie, con tres a cinco septos. De acuerdo con Leslie y Summerell (2006) y Booth (1988), este hongo cumple con las características de Fusarium proliferatum, reportándose como parásito facultativo ocasionando síntomas similares a los reportados por Seefelder et al. (2002) y Liu et al. (2007).

Identificación molecular. Los productos resultantes de la extracción de ADN obtuvieron umbrales de concentración de 186.8 544 ng μL-1 y pureza 1.38 2.22 nm. El alineamiento de las tres secuencias en el banco de genes (GenBank) del NCBI confirmó la identificación de F. proliferatum con un 99 100% de homología

Síntomas de marchitez en cultivo de esparrago de 6 años de edad. A) Parcela de espárrago con síntomas de declinamiento generalizado; B) Planta con síntomas de marchitez generalizada; C) Planta con síntomas de marchitez inicial; D) Pudrición de rizoma causada por Fusarium proliferatum; E) Parte basal del tallo con síntomas de ahogamiento; F) Parte basal del tallo con taponamiento de haces vasculares.

. Los aislados se registraron en el GenBank con las accesiones ON738483 (P1SIR), ON738484 (P3DR) y ON973801 (P5DR). La presencia y prevalencia de F. proliferatum como principal patógeno en espárrago se ha reportado en los principales estados productores de esta hortaliza (Quilambaqui et al., 2004; CamachoAguiñiga et al., 2016). La incidencia de este patógeno en el rizoma, así como su prevalencia en áreas de producción en el municipio de Atenco, puede deberse a la movilización de material propagativo para el establecimiento de nuevas parcelas productoras de espárrago.

Por otra parte, la construcción del árbol filogenético permitió agrupar las tres secuencias en un grupo de acuerdo con la homología en ellas, y dejó como cla do externo la secuencia de F. verticillioides (EU364864.1). Esta especie estuvo distante del nodo principal de F. proliferatum de modo contrario que F. fujiku roi (CP023090.1), el cual se presentó en el mismo clado (Figura 2). La distancia y organización entre clados coincide con lo propuesto por Aoki et al. (2014) y Mendoza-Ramos et al. (2021); ya que, en el árbol filogenético que estos autores presentaron, F. proliferatum pertenece al complejo F. fujikuroi. Sin embargo, es necesario remarcar que F. proliferatum conforma un grupo evolutivo diverso, por lo que podrían requerirse estudios complementarios (Leslie y Summerell, 2006).

Aislados de F. proliferatum utilizados para las pruebas de patogenicidad por diferentes métodos de inoculación. A) Árbol filogenético concatenado de los aislados ON738483 (PISIR), ON738484 (P3DR) y ON973801 (P5DR) con los iniciadores ITS 4-ITS5, EF688-EF1521, TUB T1-BT2B. B) Colonización del rizoma por el aislado P1SIR, C) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, D) macro y microconidios a 40X. E) Colonización del rizoma por el aislado P3DR, F) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, G) macro y microconidios a 40X. H) Colonización del rizoma por el aislado P5DR, I) crecimiento micelial de Fusarium en anverso y reverso en medio PDA con 7 días de crecimiento, J) macro y microconidios a 40X.

Pruebas de patogenicidad. Con el método de inoculación mediante papel absorbente, se evidenció distribución del inóculo únicamente en la parte de contacto del rizoma con papel filtro (Figura 3 B). Resultado coincidente con lo reportado por

Métodos de inoculación con aislados de Fusarium en rizomas de esparrago. A) Inmersión de rizoma por 12 h; B) Inoculación con papel filtro; C) Inmersión de rizoma por 30 min, mostrando el rizoma suspendido por malla desinfestada y papel absorbente húmedo dentro de una caja cuadrada estéril; D) Rizoma por el método inmersión por 12 h E) Rizoma por el método inoculación con papel filtro F) Rizoma por el método de inmersión por 30 min.

Cardona-Piedrahita y Castaño-Zapata (2019) los cuales utilizaron discos de agar con crecimiento micelial de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici en contacto con la raíz de Solanum lycopersicum. El método de inoculación por inmersión por 30 min mostró crecimiento micelial uniforme de tonalidades blancas concentrado en el rizoma, debido a que este tejido es un reservorio importante de fuentes de carbono con alto contenido de carbohidratos, esto explica la colonización de F. proliferatum concentrada en el rizoma, ya que, si bien es cierto que en la raíz hay contenido de nutrientes, en el rizoma por ser un sitio de organogénesis hay niveles más altos de carbohidratos y aminoácidos (Farahani-Kofoet et al., 2020).

En el método de inmersión en tubos de ensayo por 12 h ocurrió la misma colonización centrada en el rizoma; sin embargo, presentó una actividad fermentativa derivada de la ausencia de oxígeno y por lo tanto una pérdida en la estructura de pared celular del rizoma por efecto de hidrólisis (Corrales et al., 2015), mostrando una maceración de la epidermis por este efecto. En este método, la maceración interfirió con la colonización de los aislados de F. proliferatum (Figura 3 D).

Determinación de severidad. La comparación de medias de los diferentes métodos de inoculación, mostraron que la presencia de necrosis y colonización del rizoma se expresó en el método de inoculación por 12 h (17.5%), seguido del método de inmersión por 30 min (16.1%), papel filtro (6.5%) y testigo (0.3%). Este último presentó oxidación natural del rizoma por ausencia del medio edáfico (Figura 4).

Porcentaje de severidad de tres aislados de F. proliferatum en espárrago bajo tres métodos de inoculación y un testigo sin inocular.

Los resultados indicaron que el aislado P3DR fue el más severo (7.6% en papel filtro y 18.9% por el método de inmersión por 12 h) en todos los métodos evaluados, superando en promedio por 3.0 y 0.7 % al aislado P5DR y P1SIR (Figura 4). Ángel-García et al. (2018), evaluaron diferentes métodos de inoculación de Fusarium solani f. sp. passiflorae en plántulas de maracuyá (Passiflora edulis), donde obtuvieron un 100% de severidad de la secadera del maracuyá a los 6 días de la inoculación con el método de inmersión. En esta investigación, se obtuvo una severidad inferior al 19%; no obstante, se confirma el potencial de los aislados para inocular y causar síntomas, confirmando la patogenicidad de los tres aislados de F. proliferatum colectados en parcelas productoras de esparrago en Atenco, Edo. de México. La colonización en los rizomas de espárrago en este experimento correspondió a lo reportado por Stephens y Elmer (1988) y Farahani-Kofoet et al. (2020). De acuerdo con en el análisis de medias por el método de LSD de Fisher, se agruparon los tratamientos de inmersión (30 min y 12 h) en un bloque y el tratamiento por papel filtro y testigo en otro grupo. Por otro lado, entre los aislados de F. proliferatum se agruparon un grupo a P5DR y P1SIR, mientras que P3DR en otro grupo. Esto se confirma en la figura 4, donde se observa menor severidad de este último aislado en comparación con los aislados P5DR y P1SIR. La variación de severidad se ha reportado como factor de patogénesis, mencionando que este componente está estrechamente relacionado con la producción de enzimas degradadoras de la pared celular de la planta como factor de patogénesis para tener contacto con las fuentes de carbono del rizoma (Farahani-Kofoet et al., 2020).

Se determinó que el aislado P3DR fue el más severo de acuerdo con la colonización y determinación de pixeles observados en los experimentos de métodos de inoculación. Aunque los métodos de inoculación empleados en este estudio indujeron colonización de F. proliferatum en los rizomas, el método de inmersión de rizomas por 30 min fue el más efectivo.

Los aislados colectados en esta investigación se registraron con los I.D. de accesiones ON738484 (P3DR), ON973801 (P5DR) y ON738483 (P1SIR) en el banco de genes del NCBI.

Aplicando criterios morfológicos, genómicos y patogénicos se identificó Fusarium proliferatum como el agente causal de la pudrición del rizoma del espárrago (Asparagus officinalis) en el genotipo Sulken en el municipio de Atenco, Edo. de México. Este es el primer reporte de este hongo en el Edo. de México. Esta información permitirá operar bajo el principio de prevención y establecer medidas de manejo en parcelas productoras de espárrago en la zona.

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Objective/Background. The objective of this research was to identify the causal agent of asparagus rhizome rot, as well as evaluate different inoculation methods and the severity of the isolates.

Materials and methods. Sampling was carried out in five producing plots Atenco, Edo. from Mexico. Five isolates of Fusarium spp. were selected. (one per plot) to perform pathogenicity tests. Three isolates were selected for their colonization characteristics for severity tests with different inoculation methods: Immersion for 12 h, immersion for 30 min and inoculation by contact with absorbent paper soaked in 1 mL of inoculum. Concentrations of 1x106 conidia mL-1 were used. 10 rhizomes were used per treatment and 10 rhizomes without inoculation. To determine the severity, photographs (in GIMP®) of the rhizome were analyzed seven days after inoculation. The isolates were molecularly identified with ITS4/ ITS5, EF688/EF1521 and TUBT1/BT2B.

Results. Fusarium prolifetatum was morphologically and molecularly identified in the three isolates. The P3DR isolate was the most severe (14.6%), followed by P5DR (13.9%) and P1SIR (11.6%).

Conclusion. The most effective inoculation method was immersion for 30 min. They were registered in the NCBI Gene Bank with accessions ON738484 (P3DR), ON973801 (P5DR) and ON738483 (P1SIR). This is the first report of F. prolifetatum in the Edo. from Mexico.

 Keywords: Fusarium proliferatum asparagus severity inoculation. Introduction

The asparagus (Asparagus officinalis) is a vegetable, originally from Eastern Europe, Caucasus and Siberia (Faostat, 2019). However, it is a cash crop, since more than 90% of the production of this vegetable is exported to the United States of America and Europe. The economic value of the national production in 2018 rose to 7,7 billion pesos, after producing 206, 225 t (SIAP, 2020). Sonora (129,808 t), Guanajuato (27,146 t), Baja California (27,070 t), Baja California Sur (16,917 t) and Querétaro (5,284 t) are the main producers of this vegetable and they concentrated 99% of the national export supply (SIAP, 2022).

Asparagus is a perennial, diploid monocotyledonous plant, whose commercial part is the shoots that develop from the buds located in the apical part of the rhizome (Moreno-Pinel et al., 2021). Once the shoots reach a commercial length, they are cut with a blade by making an incision between the base of the shoot and the rhizome, causing wounds on the plant, making it vulnerable to the entrance of pathogens (Moreno-Pinel et al., 2021). Within the Asparagus genus, only this species is economically important (Faostat, 2019).

Despite its importance, the crop is affected in all its phenological stages by the rotting of the rhizome caused by species of the Fusarium genus. The incidence of this pathogen is reflected in the development of shoots (Quilambaqui et al., 2004). Fusarium proliferatum is the most important species reported as a pathogen worldwide, and its importance lies in the severity with which it attacks the rhizome of susceptible genotypes (Elmer, 1996; Moreno-Pinel et al., 2021). In addition, Fusarium spp. Has been reported as a producer of toxins found in marketable asparagus shoots. The presence of these toxins such as B1, B2 and B3 Fumonisins poses a risk to human health and are found in shoots produced in diseased plants (Seefelder et al., 2002; Liu et al., 2007).

In the ejido center of the municipal area of Atenco, State of Mexico, the asparagus crop has gained significant importance due to its profitability and adaptation to the soil and climate conditions of the area. The crop currently covers 20 hectares, all of them with varying ages, levels of technology and management practices. However, in all the production areas, problems have arisen regarding the rotting of the rhizome, resulting in direct economic losses for farmers. Atenco is an area with the potential to expand asparagus cultivation, and due to the increase in the incidence of this disease, this study was undertaken with the aim of identifying the causal agent of the rotting of the asparagus rhizome, evaluating its pathogenicity with different inoculation methods and evaluating the severity of the isolates obtained.

Collecting plant tissue. Five plants were sampled in every plot (across five plots) that displayed symptoms of decline, wilting and yellowing during the flowering- fruiting phenological stage in the municipal area of Atenco, State of Mexico.

Samples were collected using a shovel disinfested with alcohol at 70%, partially unearthing the rhizome and cutting approximately 50 to 10 cm in diameter. All sampling sites had the same genotypical variables and low technological inputs. A handheld Garmin Reach Explorer® GPS navigator was used to georeference each sampling point. The samples were labelled, registered with an I.D. (Table 1), packed in poly-paper bags and transported in a cooler for processing in the Laboratorio de Fitosanidad - Fitopatología (Plant Health - Plant Pathology Lab) of the Colegio de Postgraduados Campus Montecillo, State of Mexico.

Asparagus plots sampled with symptoms of decline and wilting with low technology (gravity irrigation and without mulching) inorganic agronomic management and the phenological stage of flowering-fruiting, in Atenco, State of Mexico.
I.D. Plot Coordinates Age (years) Genotype
P1SIR San Indalecio 19° 33” 24´ N 98° 55” 54´W 3 Sulken
P2DR Diamante 19° 33” 01´ N 98° 56” 14´ W 5 Sulken
P3DR Diamante 19° 33” 02´ N 98° 56” 15´ W 6 Sulken
P4DR Diamante 19° 33” 03´ N 98° 56” 15´ W 6 Sulken
P5DR Diamante 19° 33” 10´ N 98° 56” 10´W 6 Sulken

Isolation and purification. The rhizome tissues were washed with sterile demineralized water to eliminate any excess soil. Each rhizome sample was cut into 1 × 1 cm pieces using a previously disinfested scalpel with the aid of a Iroscope® YZ-6 microscope. Subsequently, the tissue was disinfested with 1% sodium hypochlorite for 2 min, washed with demineralized water three times and transferred to Petri dishes with Potato-Dextrose-Agar (PDA) from Difco Laboratories®. For every plant (five plants per plot), six pieces of rhizome were planted per dish. The Petri dishes were incubated for two days at 28 °C in a Riossa® Series-33 incubator. When mycelial growth was observed, they were purified using the hyphal tip method in new Petri dishes with PDA medium. From the mycelial growth using the hyphal tip method, monosporic cultures were obtained. By scraping with a curved dissection needle, the mycelial growth from the hyphal tip was transferred to a 50 mL Falcon tube with sterile demineralized water, shaken using a Vortex WiseMix® and the conidia were counted using a Neubauer hematocytometer. Later, dilutions were carried out, up to 1 × 106 conidia mL-1. From the last suspension, 100 μL were taken and poured into a Petri dish with PDA and distributed with a sterile Digralsky loop, incubated at 28 °C until individual mycelial growth was observed, to obtain monosporic growths.

Morphological identification. The morphological identification was carried out using the taxonomic keys reported by Leslie and Summerell (2006) and Booth (1988). The isolates were planted in a Carnation-Agar culture for the production of macroconidia. Later, fixed preparations were made to be observed under a compound microscope (10x and 40x Velab VE-B2) integrated with the Program Motic Images Plus v2.0. The mycelial coloring was established, along with the conidial morphology and morphometry in 60 conidia per isolate aged 7 days after planting.

Pathogenicity tests. Inoculations were carried out in 3-month-old Sulken asparagus seedlings. Five Fusarium spp. inoculates were isolated at a concentration of 1x106 conidia mL-1 with three repetitions per treatment. There were non-inoculated rhizomes (controls) from each isolate. Three inoculation methods were established:

Immersion in test tubes 1. The root areas of the seedlings were submerged in test tubes containing 50 mL of 1 × 106 of a conidial suspension for 30 min. (Modified from Farahani-Kofoet et al., 2020).

Immersion in test tubes 2. The same methodology described above was carried out, but in a volume of 10 mL of a conidial suspension and it was introduced in the rhizome for 12 h.

Inoculation by filter paper. Whatman No. 4 filter paper circles, each one mea- suring 5 mm in diameter, were soaked in a 1 x 106 conidial suspension for 2 min. Subsequently, the filter paper circles were placed on the apical area of the rhizome without lesions. The rhizomes were evaluated 7 days after inoculation. The culture was then observed under a stereoscopic microscope and only three isolates were reisolated which, due to their colonization characteristics, were evaluated to deter- mine severity.

Severity evaluation. The same inoculation methodology described above was followed, with 10 repetitions per treatment and control. Photographs were taken of the most affected area of each repetition. The images were taken using a Canon® (Reflex EOS REBEL T7, 20.2 mp) camera. A total of 120 photographs were processed in GIMP® v2.10, to quantify the total area in pixels (At) and damaged area (Ad) to determine the severity. The percentage of severity was obtained using the following area:

The data were analyzed using an ANOVA in the SAS 9.4 software to determine the most severe isolate and the most effective inoculation method, according to the means analysis using Fisher’s LSD method (Abramoff et al., 2004).

Molecular identification and phylogenetic analysis. DNA was extracted from three isolations using the CTAB technique at 2% (Minas et al., 2011). The concentration and purity of the nucleic acids were determined using spectrophotometry with NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific 2000, U.S.A.). The species was confirmed molecularly by PCR with the primers ITS 4/ITS5, EF688/EF1521 and TUB T1/BT2B (Table 2) in a T-100 (BioRad) thermocycler with a final sample volume of 15 µL composed of: 7.86 µL of HPLC water, 3 µL of 5X PCR buffer,

0.6 µL of dNTP´s, 0.18 µL of the primers (10 µM) (Sigma-Aldrich, U.S.A.), 3 µL of genomic DNA (20 ng) and 0.18 µL (2U) of GoTaq® polymerase DNA (Promega, U.S.A.) (Table 2). The amplified fragments were analyzed by electrophoresis in 1.5% agarose gel stained with ethidium bromide and viewed with UV light in a

Primers used, sequence, region of the amplified gene, amplicon size, and PCR conditions for the genomic identification of Fusarium species.
Primers Sequence Region pb PCR conditions Reference
ITS 4 ITS 5 5´-TCCTCCGCTTATTGATAT 5´-GGAAGTAAAAGTCGTAAC Internal transcribed spacer region rRNA 565 zID: 95 °C 4 min 35 cycles D: 95 °C 1min A: 58 °C 1min E: 72 °C 2min EF:72 °C 10 min White et al., 1990
FE688 FE1521 5´-CGGTCACTTGATCTACAA 5´-CCTCGAACTCACCAGTAC Translation elongation factor 1-α 650 ID: 95 °C 3 min 35 cycles D: 95 °C 35 s A: 59 °C 55s E: 72 °C 1:30 min EF:72 °C 10 min Alves et al., 2008
TUB T1 BT2B 5´AAYATGATIACIGGIGCIGCI 5´-ACCCTCAGTGTAGTGACC β-tubulin Constitutive protein 560 ID: 95 °C 5 min 35 cycles D: 95 °C 1 min A: 58 °C 1 min E: 72 °C 1:30 min EF:72 °C 5 min O’Donnell et al.,1998

z Initial denaturalization (ID), Denaturalization (D), Alignment (A), Extension (E) and Final extension (FE).

photo documenter (UVP, Biolmaging Systems, Epi Chemi II Darkroom). The PCR products were sent to be sequenced to Macrogen®, Korea. The sequences were cleaned and edited with the program BIOEDIT® for comparison in the National Center for Biotechnology Information (NCBI) database.

For the phylogenetic analysis, a classification was performed using UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic), using the standard MEGA 1 parameters. The sequences of F. verticillioides (EU364864.1) y F. fujikuroi (CP023090.1) were chosen as reference species for the creation of the phylogenetic tree.

Morphological identification. The symptoms observed on the field were general wilting and yellowing (Figure 1 A-B). When making a transverse cut at the base of the stem, necrosis and blockage of vascular bundles were observed (Figure 1 D-F). A similar growth was observed in all the rhizome tissue plantations in the five plots; therefore, one isolation was selected from every field. In a PDA medium, isolations P1SIR and P5DR displayed a radial growth with whitish-yellow shades in the front and yellowish-brown tones on the back. Isolation P3DR displayed a mycelium with a white tone, cottonlike characteristics and radial growth. Ten days after planting, all isolates displayed the presence of monophialides and polyphialides, along with false heads or aggregates of microconidia with flat bases, and chains of microconidia without chlamydospores were also observed. The macroconidia proliferated in the Carnation-Agar medium, where the morphometry was 26.47 µm x 4.43 µm (P1SIR), 25.97 x 4.92 µm (P3DR) and 26.21 µm x 4.76 µm in length and width (P5DR). All macroconidia displayed a curved apical cell and a foot-shaped basal cell, with three to five septa. According to Leslie and Summerell (2006) and Booth (1988), this fungus complies with the characteristics of Fusarium proliferatum, and it was reported as a facultative parasite, causing similar symptoms to those reported by Seefelder et al. (2002) y Liu et al. (2007).

Molecular identification. The products of the DNA extraction obtained concentration thresholds of 186.8 - 544 ng μL-1 and purity of 1.38 - 2.22 nm. The alignment of the three sequences in the GenBank of the NCBI confirmed the identification of F. proliferatum with a homology of 99 - 100%. The isolations were registered in the GenBank with accessions ON738483 (P1SIR), ON738484 (P3DR) y ON973801 (P5DR). The presence and prevalence of F. proliferatum as the main pathogen in asparagus has been reported in the main asparagus producing states (Quilambaqui et al., 2004; Camacho-Aguiñiga et al., 2016). The incidence of this pathogen in the rhizome, as well as its prevalence in production areas in the municipal area of Atenco may be due to the mobilization of propagational material for the establishment of new asparagus producing plots.

Symptoms of wilting in 6-year-old asparagus crop. A) Asparagus crop with symptoms of generalized decline; B) Plant with symptoms of generalized wilting; C) Plant with symptoms of initial wilting; D) Rotting of the rhizome caused by Fusarium proliferatum; E) Basal part of the stem with symptoms of F) Basal part of the stem with vascular bundle blockage.

On the other hand, the creation of the phylogenetic tree helped group the three sequences in one same group, according to the homology in them, and left the sequence of F. verticillioides (EU364864.1) as an external clade. This species was distant from the main node of F. proliferatum as opposed to F. fujikuroi (CP023090.1), which appeared in the same clade (Figure 2). The distance and organization between clades coincide with the proposal by Aoki et al. (2014) and Mendoza-Ramos et al. (2021) since, in the phylogenetic tree that these authors presented, F. proliferatum belongs to the F. fujikuroi complex. However, it is important to point out that F. proliferatum makes up a diverse evolutionary group, therefore further studies may be required (Leslie and Summerell, 2006).

F. proliferatum isolations used for the pathogenicity tests via different inoculation methods. A) Concatenated phylogenetic tree of isolates ON738483 (PISIR), ON738484 (P3DR) and ON973801 (P5DR) with the primers ITS 4-ITS5, EF688-EF1521, TUB T1-BT2B. B) Rhizome colonization by isolate P1SIR, C) Mycelial growth of Fusarium on the front and back of PDA medium after 7 days of growth, D) Macro and microconidia at 40X. E) Rhizome colonization by isolation P3DR, F) Mycelial growth of Fusarium on the front and back of PDA medium after 7 days of growth, G) Macro and microconidia at 40X. H) Rhizome colonization by isolate P5DR, I) Mycelial growth of Fusarium on the front and back of PDA medium after 7 days of growth, J) Macro and microconidia at 40X.

Pathogenicity tests. With the inoculation method using filter paper, the inoculant was found to be distributed only in the area in which the rhizome was in contact with the paper (Figure 3 B). This result coincides with reports by Cardona-Piedrahita and Castaño-Zapata (2019), who used agar discs with Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mycelial growth in contact with the root of Solanum lycopersicum. The inoculation method by immersion for 30 min displayed an even mycelial growth with whitish tones concentrated in the rhizome, since this tissue is an important reservoir of carbon sources with a high content of carbohydrates, thus explaining the colonization of F. proliferatum concentrated in the rhizome since, despite the nutrients found in the root, the rhizome, because it is an organogenesis site, contains higher levels of carbohydrates and amino acids (Farahani-Kofoet et al., 2020).

Inoculation methods with Fusarium isolations in asparagus rhizomes. A) Immersion of rhizome for 12 h; B) Inoculation with filter paper; C) Immersion of rhizome for 30 min, showing the rhizome suspended by disinfected mesh and moist filter paper inside a sterile square box; D) Rhizome by the immersion method for 12 h E) Rhizome by the inoculation method with filter paper F) Rhizome by the immersion method for 30 minutes.

In the method of immersion in test tubes for 12 h, the same rhizome-centered colonization took place. However, it presented a fermentation activity derived from the absence of oxygen and therefore a loss in the structure of the rhizome’s cell wall due to hydrolysis (Corrales et al., 2015), leading to a maceration of the epidermis. In this method, maceration interfered with the colonization of the F. proliferatum isolates (Figure 3 D).

Determining the severity. The comparison of the means of the different inoculation methods showed that the presence of necrosis and colonization of the rhizome was expressed in the method of inoculation for 12 h (17.5%), followed by the method of immersion for 30 min (16.1%), filter paper (6.5%) and control (0.3%). The latter method presented a natural oxidation of the rhizome due to a lack of an edaphic medium (Figure 4).

Percentage of severity of three F. proliferatum isolates in asparagus under three inoculation methods, and a control, not inoculated.

The results indicated that isolation P3DR was the most severe (7.6% in filter paper and 18.9% by the method of immersion for 12 h) out of all of the methods evaluated, surpassing P5DR and P1SIR by an average of 3.0 and 0.7% (Figure 4). Ángel-García et al. (2018), evaluated different Fusarium solani f. sp. passiflorae inoculation methods in passionfruit seedlings (Passiflora edulis), where they obtained 100% severity of passionfruit damping-off 6 days after inoculation using the immersion method. In this investigation, the severity obtained was below 19%. However, the potential for the isolations to inoculate and cause symptoms was confirmed, thus confirming the pathogenicity of the three F. proliferatum isolations gathered from asparagus producing plots in Atenco, State of Mexico. The colonization in the asparagus rhizomes in this experiment coincided with reports by Stephens and Elmer (1988) and Farahani-Kofoet et al. (2020).

According to the analysis of means with Fisher’s LSD method, the immersion treatments (30 min and 12 h) were grouped in one block and the treatment with filter paper and the control on another one. On the other hand, among the F. proliferatum isolates, P5DR and P1SIR were grouped in one block, whereas P3DR was placed in another group. This is confirmed in Figure 4, where a lower severity is confirmed for the latter isolate in comparison with the P5DR and P1SIR isolates. The variation in severity has been reported as a pathogenesis factor, mentioning that this component is closely related to the production of enzymes that degrade the cell walls of the plant as a pathogenesis factor to be in contact with the carbon sources of the rhizome (Farahani-Kofoet et al., 2020).

Isolate P3DR was determined to be the most severe, according to the colonization and determination of pixels observed in the experiments of inoculation methods. Although the inoculation methods used in this study induced the colonization of F. proliferatum in the rhizomes, the method of immersion of rhizomes for 30 min was the most effective.

The isolates gathered in this study were registered with accession ID numbers ON738484 (P3DR), ON973801 (P5DR) and ON738483 (P1SIR) in the NCBI gene bank.

Applying morphological, genomic and pathogenic criteria Fusarium proliferatum was identified as the causal agent of the rotting of the asparagus (Asparagus officinalis) rhizome in the genotype Sulken in the municipal area of Atenco, State of Mexico. This is the first report of this fungus in the State of Mexico. This information will help operate under the principle of prevention and implement management measures in asparagus-producing plots in the area.