rmfiRevista mexicana de fitopatologíaRev. mex. fitopatol0185-33092007-8080Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C.10.18781/R.MEX.FIT.2305-2Artículo CientíficoInducción de respuesta de defensa por inulina de tubérculos de dalia (Dahlia sp.) en Capsicum annuumLópez-Velázquez,Julio César1García-Morales,Soledad1Qui-Zapata*,Joaquín Alejandro1García-Carvajal,Zaira Yunuen2Navarro-López,Diego Eloyr3García-Varela,Rebeca3 Biotecnología Vegetal, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, AC (CIATEJ). Unidad Zapopan, Camino Areneno, 1227, Zapopan, Jalisco, CP 45019, México; Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, ACCentro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, AC (CIATEJ)ZapopanJalisco45019Mexico Biotecnología Médica y Farmacéutica, CIATEJ. Unidad Guadalajara, Avenida Normalistas, 800, Guadalajara, Jalisco, CP 44270, México; Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, ACCIATEJGuadalajaraJalisco44270Mexico Departamento de Bioingeniería, Escuela de Ingeniería y Ciencias, Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey. Campus Guadalajara, Ramón Corona, 2514, Zapopan, Jalisco, CP 45201, México.Escuela de Ingeniería y Ciencias, Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de MonterreyEscuela de Ingeniería y Ciencias, Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de MonterreyZapopanJalisco45201MexicoAutor de correspondencia: Joaquín Alejandro Qui-Zapata. jqui@ciatej.mx17102024Jan-Apr2024421RMEXFIT2305-21005202311122023Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsResumenObjetivo/Antecedentes.
Phytophthora capsici es el agente causal de la marchitez del chile. Entre las estrategias para su control está el uso de inductores de resistencia. Los fructanos son moléculas que presentan propiedades biológicas interesantes, incluyendo la capacidad de inducir mecanismos de resistencia en algunas plantas. En este trabajo se evaluó el efecto de protección de cuatro concentraciones de inulina de tubérculos de dalia en chile infectado con P. capsici.
Materiales y Métodos.
La concentración que presentó mayor protección se eligió para evaluar la inducción de respuesta de defensa mediante la actividad enzimática de β-1,3 glucanasas, peroxidasas y la producción de compuestos fenólicos totales.
Resultados.
La inulina mostró un efecto protector contra la infección a concentraciones de 100 a 300 μM, ya que disminuyeron los síntomas y las plántulas mostraron mejor desarrollo vegetativo. Se observó que la inulina en concentración 200 μM indujo una respuesta de defensa efectiva asociada al aumento de la actividad de β-1,3 glucanasas y peroxidasas mediante una respuesta local y sistémica en las plántulas. Esta respuesta fue diferenciada entre las plántulas tratadas con inulina y las plántulas infectadas con P. capsici.
Conclusión.
Se concluyó que la inulina tiene la capacidad de proteger al chile de P. capsici por la inducción de resistencia.
El chile (Capsicum annuum) es un cultivo de importancia económica en México, su producción se estima en 3,112,481 toneladas anuales, lo que posiciona al país como el cuarto productor de chile a nivel mundial en 2022 (SADER, 2023). Sin embargo, este cultivo es afectado por diferentes patógenos incluyendo virus, bacterias, oomicetos y hongos, que ocasionan alteraciones metabólicas en el cultivo, limitando el rendimiento y la calidad del fruto (Ramos-Sandoval et al., 2010; Majid et al., 2017). La marchitez o secadera del chile, considerada como la enfermedad más destructiva para el cultivo (Barchenger et al., 2018), se asocia principalmente al oomiceto Phytophthora capsici, que se propaga por el agua de riego y lluvia a través de oosporas y zoosporas (Sanogo et al., 2023). Las pérdidas económicas relacionadas con esta enfermedad se consideran de gran importancia para el agricultor y su control significa un aumento considerable en los costos de producción del cultivo (Moreira-Morrillo et al., 2022).
En México, se han desarrollado distintos estudios sobre la presencia, diversidad genética y búsqueda de variedades de chile resistentes contra de este patógeno (Castro-Rocha et al., 2016; Palma-Martínez et al., 2017; Pons-Hernández et al., 2020). Se han obtenido aislados en diferentes especies y variedades de chile provenientes de zonas productoras de Aguascalientes, Chihuahua, Guanajuato, Jalisco y Michoacán, además de caracterizar la distribución del patógeno y su gama de hospedantes en cultivos de importancia económica de las familias Solanaceae y Cucurbitaceae (Reyes-Tena et al., 2021).
Para el control de la marchitez del chile, se exploran diferentes alternativas, como los inductores de resistencia o defensa vegetal, que pueden ser péptidos, polisacáridos, lípidos, entre otros tipos de biomoléculas. Su mecanismo de acción es la generación de una respuesta de defensa inducida o “priming”, que incluyen cambios a nivel fisiológico, molecular o epigenético como consecuencia de la percepción de un estímulo relacionado con un proceso de patogénesis, donde la planta genera una respuesta de resistencia que la mantiene protegida ante el ataque posterior de patógenos (Hönig et al., 2023).
Se han reportado diferentes moléculas como inductores de resistencia contra el género Phytophthora. Desde fitohormonas como el ácido jasmónico y jasmonato de metilo que demostraron retardar el progreso de la infección de P. infestans en papa (Arévalo-Marín et al., 2021). Hasta fungicidas de bajo espectro como el fosfito de potasio, un análogo funcional del ácido salicílico como el acibenzolar-S-metil y un aminoácido no proteico como el ácido β-aminobutírico (BABA) que redujeron las lesiones y síntomas de la enfermedad asociada a P. infestans en tomate de árbol (Solanum betaceum) (Castaño-Monsalve et al., 2015).
El género Dahlia incluye plantas herbáceas perennes que se caracterizan por sus inflorescencias con flores liguladas y discoides, con raíces tuberosas, desarrolladas a partir de un rizoma corto. Este género cuenta con 38 especies, de las cuales 35 son endémicas de México (Carrasco-Ortiz et al., 2019). El principal uso de la dalia es como planta ornamental; aunque en la actualidad se están promoviendo sus beneficios medicinales y nutricionales. Particularmente, las raíces tuberosas se caracterizan por su contenido de fibra, proteína, minerales y vitaminas, así como por su alto porcentaje de carbohidratos, en forma de inulina y otros fructanos (HernándezEpigmenio et al., 2022). Dependiendo de la madurez de la raíz y de la especie, el contenido de inulina puede fluctuar entre 52 y 83 % de carbohidratos presentes en los tubérculos (Santana-Legorreta et al., 2016). En este sentido, los fructanos son polímeros compuestos por unidades de fructosa unidas mediante enlaces de tipo β(2-1) y/o β(2-6) que generalmente tienen un resto de glucosa terminal y algunos derivados han sido reportados como inductores de defensa vegetal para algunos cultivos (Sun et al., 2013; Zhang et al., 2009; Zhang et al., 2013). Para el cultivo del chile (C. annuum), se ha reportado la aplicación de fructanos de agave (Agave tequilana var. Azul) de diferentes grados de polimerización y concentraciones induciendo un efecto protector contra los síntomas severos de la infección con P. capsici, disminuyendo la incidencia y daño a la raíz por su aplicación foliar (Navarro-López et al., 2019). También, se ha reportado que la aplicación de inulina (200 µM) a la base de la planta de chile disminuyó la incidencia de la enfermedad y el daño de la raíz provocado por P. capsici hasta un 40 % (López-Velázquez et al., 2019a). Esta protección de la inulina se pudo incrementar hasta en un 80 % con el uso de hidrogeles biodegradables que protegieron de la lixiviación y degradación al polímero en el suelo (López-Velázquez et al., 2019b). En los tres estudios se evaluó la protección a la enfermedad con la disminución de la incidencia, daño a la raíz y presencia del patógeno en la raíz, aunque no se realizaron ensayos para determinar si esta protección se desencadenó por la inducción de resistencia en la planta.
Considerando la importancia de validar que la protección dada por la aplicación de la inulina se asocia con la inducción de mecanismos de defensa vegetal, así como el efecto de diferentes dosis del polímero, en este trabajo el objetivo fue evaluar el efecto de protección de cuatro concentraciones de inulina de tubérculos de dalia grado reactivo aplicadas a la base de la planta de chile. La concentración que presentó la mayor protección se evaluó su inducción de una respuesta de defensa bioquímica efectiva mediante la actividad enzimática de β-1,3 glucanasas, peroxidasas y la producción de compuestos fenólicos totales.
Materiales y Métodos
Localización y Área de estudio. La presente investigación se desarrolló en las instalaciones de la Unidad de Biotecnología Vegetal del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco AC. Unidad Zapopan, entre los meses de agosto-diciembre de 2018.
Material Vegetal. Se utilizaron semillas de chile serrano (Capsicum annuum) cv. Camino Real (Harris Moran Seed Company). Las semillas se desinfestaron sumergiéndose por 3 minutos en hipoclorito de sodio comercial (NaClO) al 3 %, posteriormente se enjuagaron con agua destilada y se colocaron para su germinación en charolas con sustrato estéril compuesto de peat-moss, arena y vermiculita en proporción 6:2:1, respectivamente.
Material biológico. Se utilizó la cepa de Phytophthora capsici (CH11) de la colección de cepas del CIATEJ, proporcionada y aislada en 2011 por la Dra. Sylvia Fernández Pavía, del Instituto de Investigaciones Agropecuarias Forestales de la Universidad Michoacana San Nicolás de Hidalgo (Reyes-Tena et al., 2019). Las condiciones de cultivo y generación del inóculo fueron las mismas que se describieron con López-Velázquez et al. (2019a).
Medio de cultivo v8 clarificado. Se utilizó jugo v8 (Campbell’s) clarificado por filtración. Se mezcló 50 mL de jugo clarificado, 0.5 g de carbonato de calcio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y 15 g de agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) en agua destilada. Esta mezcla fue colocada en agitación y aforada a 1 L con agua destilada. El medio se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 20 min (Trinidad-Cruz et al., 2021).
Soluciones de inulina de tubérculos de dalia. Se prepararon soluciones de inulina de tubérculos de dalia grado reactivo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Se disolvió en agua destilada a concentraciones 20, 100, 200 y 300 μM. La solución fue esterilizada por filtración con membranas de 20 μm antes de su aplicación.
Evaluación de la protección de inulina de dalia en el control de P. capsici. Se utilizaron 10 plántulas de chile de 30 días de edad por tratamiento, las cuales se trasplantaron en vasos de poliestireno de 275 mL con sustrato estéril compuesto de peat-moss, arena y vermiculita en proporción 6:2:1. Después del trasplante se aplicaron 10 mL de inulina de tubérculos de dalia a la base del tallo. Las concentraciones de inulina fueron 20, 100, 200 y 300 μM. Transcurridos 10 días después de la primera aplicación de la inulina, se hizo una segunda aplicación e inmediatamente después se inocularon las plántulas con 10 mL de la suspensión de zoosporas de P. capsici (1×104 zoosporas mL-1) (Wang et al., 2013). El experimento finalizó dos semanas después de la inoculación, se hizo un registro fotográfico y se determinó la altura y el peso fresco de las plántulas. Se determinó el nivel de protección a la enfermedad, considerando la siguiente escala de severidad de la enfermedad que fue propuesta con base en los síntomas observados a lo largo del experimento: 1. Plántula sana, sin síntomas evidentes de enfermedad; 2. Plántula con clorosis, oscurecimiento en tallo y raíces, marchitez en las hojas; 3. Plántula que presenta daño en las hojas, necrosis en el tallo y raíces, raíces cortas, defoliación severa y tamaño menor que el control y 4. Plántula muerta. Se utilizó un diseño experimental de bloques al azar con 10 repeticiones cada uno. Se consideraron como controles plántulas a las que se aplicó agua destilada estéril en lugar de la inulina y plántulas inoculadas solamente con el patógeno. El experimento se realizó por duplicado separados por espacio y al mismo tiempo.
Determinación del daño en las raíces. Para determinar el daño a las raíces se comparó la viabilidad de las raíces entre los diferentes tratamientos. La viabilidad se determinó con la reducción del cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) (SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA) a 1,3,5-trifenilformazan (TTF) con el método descrito por Wang et al. (2013) con algunas modificaciones (López-Velázquez et al., 2019a). La viabilidad de las raíces se obtuvo mediante el cálculo de la intensidad de reducción del TCC (mg g-1 h) = absorbancia del TTC reducido / PF h, donde PF es la masa de la raíz fresca y h es el tiempo de incubación.
Presencia del oomiceto en la raíz. Se determinó la presencia del oomiceto en la raíz del chile por la tinción del micelio con azul de tripano (López-Velázquez et al. 2019b). Se tomaron muestras de raíces y se decoloraron con hidróxido de potasio 1.7 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) y peróxido de hidrógeno 0.5 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Posteriormente fueron teñidas con azul de tripano 100 μM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) por 2 h. El exceso de colorante fue eliminado con lavados de lactoglicerol y las muestras fueron observadas en microscopio óptico (Microscopio Olympus modelo BH-2, Tokio, Japón).
Evaluación de inducción de respuesta de defensa en chile por el tratamiento con inulina de dalia contra P. capsici. Se utilizaron plántulas de 30 días de edad, las cuales se trasplantaron a bolsas de polietileno de 1 kg con sustrato estéril. Después del trasplante se aplicaron a la base de la plántula 10 mL de inulina de tubérculos de dalia a la concentración que presentó la mayor protección (200 μM), se consideró un tratamiento con inulina y el oomiceto, un tratamiento solo con el patógeno y un tratamiento con agua destilada como control. Transcurridos 10 días después de la primera aplicación de la inulina se hizo una segunda aplicación e inmediatamente después se inocularon las plantas con 10 mL de la suspensión de zoosporas de P. capsici (1×104 zoosporas mL-1) (Wang et al., 2013).
Extracción enzimática y ensayos de actividad. Se tomaron muestras de raíces y hojas de las plantas al momento de la inducción, el día de la inoculación con el patógeno (considerándose como día 0) y a los días 1, 2, 3, 5, 7 y 9 después de la inoculación con el patógeno. Se determinó la actividad enzimática de proteínas relacionadas con patogénesis (PR) con las actividades de β-1,3 glucanasas y peroxidasas. La producción de fitoalexinas se asoció con la cuantificación de compuestos fenólicos totales absorbidos a 650 nm. Las muestras fueron maceradas con nitrógeno líquido. Para la determinación de β-1,3 glucanasas y peroxidasas se resuspendieron en buffer de fosfato de sodio 0.1 M pH 7.0. Para la cuantificación de compuestos fenólicos totales se resuspendieron en metanol al 80 % (v/v).
Determinación de la actividad de β-1,3 glucanasas. Se realizó con el método colorimétrico para detección de azúcares reductores a 515 nm, como producto de la hidrólisis enzimática y la reducción del DNS (ácido 3,5-Dinitrosalicílico, SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA). La cuantificación se realizó empleando una curva de calibración con glucosa, y la actividad específica fue reportada en nanokatales (nkat) por gramo (g) de proteína total (nkat g-1 g-1 PT). Se define como 1 nkat a 1 nmol de D-glucosa liberada de la laminarina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) por segundo, bajo las condiciones del ensayo (Oliveira et al., 2014).
Determinación de la actividad de peroxidasas. Se realizó siguiendo el método propuesto por Oliveira et al. (2014). Se emplearon 10 µL de extracto de hoja y raíz para las reacciones. La variación de una unidad de absorbancia por minuto se definió como una unidad de actividad peroxidasa (1 UA) y fue expresada por gramo de proteína total (UA g-1 g-1 PT).
Determinación de la inducción de compuestos fenólicos totales. Se determinó por medio de la cuantificación de compuestos fenólicos totales siguiendo la metodología propuesta por Ainsworth and Gillespie (2007), con algunas modificaciones (López-Velázquez et al., 2019a). La cuantificación se realizó empleando una curva estándar de concentraciones conocidas de catecol (0.2 1 mM) y los resultados se expresaron como nmol catecol g -1 PF-1.
Análisis estadístico. Los datos se normalizaron con la prueba de Anderson-Darling. Posteriormente, se realizó un análisis de varianza unifactorial utilizando los procedimientos del paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI, versión 16.1.11 (Statistical Graphics, Englewood Cliffs, NJ, USA). Para la separación entre medias, se realizó un análisis mediante la prueba LSD, con un nivel de significancia del 95 %.
Resultados
Protección de inulina de dalia en el control de la infección de P. capsici en chile. Para determinar el grado de protección contra la infección de P. capsici por la aplicación de inulina de dalia en plántulas de chile serrano, se evaluaron diferentes parámetros como la disminución de los síntomas de la enfermedad, incluyendo la altura y peso fresco de la plántula, la incidencia de la enfermedad, así como el daño, viabilidad y la presencia del patógeno en la raíz. Los resultados obtenidos en la prueba de efectividad biológica mostraron que las plántulas inoculadas con el patógeno (P) tuvieron una incidencia de la enfermedad del 80 %, una severidad de la enfermedad nivel 4 y un daño a la raíz severo observado como un volumen radicular significativamente menor al control (C) (Figura 1). Además, se observó una disminución significativa en el peso fresco, la altura de la plántula y la viabilidad de la raíz con respecto al grupo control (Cuadro 1). Para las plántulas tratadas con 20 μM de inulina (I1+P), no hubo respuesta de inducción de protección, los síntomas, la incidencia, la severidad de la enfermedad y el daño a la raíz fueron semejantes a lo observado en las plántulas infectadas con P. capsici (Figura 1a). El mismo efecto se tuvo en el peso fresco, la altura de la planta y la viabilidad de la raíz (Cuadro 1). El tratamiento con 100 μM de inulina (I2+P) mostró un efecto positivo en la inducción de protección a la infección de P. capsici, con este tratamiento se presentó una incidencia del 50 % de la enfermedad, la severidad se catalogó en el nivel 3 y no se vio daño significativo en la raíz (Figura 1b). El peso fresco y la altura de la plántula fueron equivalentes al testigo, aunque la viabilidad de las raíces fue equivalente a las plántulas infectadas (Cuadro 1). Para las plántulas tratadas con 200 μM de inulina (I3+P) también se observó la inducción de protección a la infección de P. capsici, aunque con un nivel de severidad de la enfermedad de nivel 2 y una incidencia del 40 %, siendo la mejor protección observada en todos los tratamientos (Figura 1).
Finalmente, en las plántulas tratadas con 300 μM de inulina (I4+P) se observó
la inducción de protección. Se presentó una disminución de la incidencia de 50 %, la severidad de la enfermedad fue de nivel 3 y no se observó daño en la raíz (Figura 1). El peso fresco y la altura de la planta fueron equivalentes al control, aunque la viabilidad de las raíces fue equivalente a las plantas infectadas (Cuadro 1). En todos los tratamientos que fueron inoculados con el patógeno, se comprobó la infección por la presencia del micelio de P. capsici, esto indicó que el oomiceto fue capaz de colonizar las raíces (Figura 1c). En los resultados obtenidos destacó que la viabilidad por mg de raíz de las plantas tratadas con inulina no presentó diferencias significativas con respecto a las plantas infectadas con P. capsici (Cuadro 1). A partir de estos resultados se consideró el tratamiento de 200 μM de inulina (I3+P) como aquel que indujo la mejor protección contra la infección de P. capsici en las plantas
Evaluación de la inulina de dalia en la protección de la infección de <italic>P. capsici</italic> en plántulas de chile. a: Prueba de efectividad biológica de inulina en plántulas de chile, la escala equivale a 10 cm; b: Daño en las raíces, la escala equivale a 5 cm; c: Presencia del oomiceto en el tejido vegetal, la escala equivale a 20 µm, las flechas indican la presencia del oomiceto. Los tratamientos corresponden: C: Control, plántulas tratadas con agua destilada estéril; P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic>; I1+P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic> y tratadas con inulina 20 μM; I2+P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic> y tratadas con inulina 100 μM; I3+P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic> y tratadas con inulina 200 μM; I4+P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic> y tratadas con inulina 300 μM.
Parámetros de crecimiento y protección inducidas por inulina de dalia en plántulas de chile.
Tratamiento
Peso fresco (g)
Altura de la plántula (cm)
Viabilidad de la raíz (mg g-1 h PF)
Severidad de la enfermedad
Incidencia de la enfermedad (%)
C
1.8 ± 0.27a
27.7 ± 0.66a
1.7 ± 0.11 c
1
0
P
0.8 ± 0.18a
22.5 ± 2.04a
0.9 ± 0.20a
4
80
I1+P
0.7 ± 0.18a
22.1 ± 0.89a
0.9 ± 0.09ab
4
80
I2+P
1.3 ± 0.18a
26.3 ± 1.06a
1.0 ± 0.16ab
3
50
I3+P
1.8 ± 0.37bc
26.9 ± 1.54a
0.9 ± 0.35ab
2
40
I4+P
1.5 ± 0.23bc
28 ± 1.2a
0.6 ± 0.03a
3
50
Los tratamientos se describen en la figura 1. Medias con letras diferentes difieren por prueba LSD para p<0.05.
de chile. Esta concentración fue utilizada para las evaluaciones de inducción de la respuesta de defensa efectiva en chile.
Inducción de defensa en plántulas de chile por la aplicación de inulina de dalia contra P. capsici
Actividad de β-1,3 glucanasas. La respuesta en la raíz se consideró como una respuesta de defensa local y la respuesta en hojas se consideró como una respuesta de defensa sistémica. En hojas y raíces el análisis estadístico mostró diferencias significativas entre los tratamientos y los muestreos (p < 0.05). Respecto a la respuesta local (Figura 2a), la actividad de β-1,3 glucanasas en las plántulas infectadas con
P. capsici (P) aumentó de manera significativa con respecto al testigo hasta el día 5 después de la inoculación del patógeno, esta actividad se mantuvo elevada en el día 7 y disminuyó al nivel del testigo al día 9. Por su parte, en las plántulas tratadas con inulina e infectadas con P. capsici (IP) se observó un aumento en su actividad a partir del día 2 después de la inoculación del patógeno y se mantuvo elevada hasta el día 7, después se observó una disminución significativa de la actividad en el día
9. La inulina de dalia fue capaz de aumentar la actividad de β-1,3 glucanasas de
manera local y temprana en las plántulas inoculadas con P. capsici.
Con respecto a la respuesta sistémica, se observaron cambios en la actividad de β-1,3 glucanasas en las hojas en las plántulas tratadas (Figura 2b). La actividad de β-1,3 glucanasas en las plántulas infectadas (P) aumentó de manera significativa con respecto al testigo a partir del día 2 después de la inoculación del patógeno, esta actividad disminuyó al nivel del testigo en el día 3, manteniéndose al mismo nivel en el día 5, la actividad disminuyó de manera significativa en el día 7 y finalmente aumentó la actividad en el día 9. Por su parte, en las plántulas infectadas y tratadas con inulina (IP) el aumento de la actividad se observó a partir del día de la inoculación con el patógeno, este aumento se mantuvo los días 1, 2, 3 y 5, se observó una
Evaluación de la actividad β-1,3 glucanasas en raíces (a) y en hojas (b) de plántulas de chile tratadas con inulina de dalia e inoculadas con <italic>P. capsici</italic>. C: Plántulas control, tratadas con agua destilada estéril; P: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic>; I: Plántulas tratadas con 200 μM de inulina; IP: Plántulas inoculadas con <italic>P. capsici</italic> y tratadas con 200 μM de inulina. Las líneas verticales representan la desviación estándar. Los asteriscos representan diferencias significativas con respecto al testigo.
disminución al nivel del testigo al día 7 y de nuevo un aumento significativo en el día 9. La inulina de dalia fue capaz de aumentar la actividad de β-1,3 glucanasas de manera sistémica y temprana en las plantas inoculadas con P. capsici.
Actividad de peroxidasas. En este estudio, se evaluó la actividad de enzimas con actividad de peroxidasas en hojas y raíces de plántulas de chile inoculadas con P. capsici y tratadas con inulina de dalia. Respecto a la respuesta local, se observó una diferencia estadística entre muestreos y tratamientos (p < 0.05) (Figura 3a). La actividad de peroxidasas en las plántulas infectadas con P. capsici (P) disminuyeron de manera significativa al día 2 después de la inoculación del patógeno, esta actividad se mantuvo baja, aunque con niveles cercanos al testigo los días 3 y
5. Se observó un aumento significativo de la actividad de peroxidasas en el día 7 y una nueva disminución al nivel del testigo al día 9. Por su parte, en las plántulas tratadas con inulina e infectadas con P. capsici (IP) se observó un aumento en su actividad a partir del día de la inoculación del patógeno. Esta actividad disminuyó al nivel del testigo a partir del día 1 y se mantuvo al nivel del testigo hasta el día 2. Se observó una disminución significativa de la actividad hasta el día 3 y un aumento significativo a partir del día 5 que se mantuvo los días 7 y 9. La inulina fue capaz de aumentar la actividad de peroxidasas de manera local y temprana en las plantas infectadas con P. capsici.
Se observó una respuesta sistémica al presentarse cambios en la actividad de peroxidasas en las hojas (Figura 3b). La actividad de peroxidasas en las plántulas infectadas con P. capsici (P) aumentó de manera significativa al día 1 después de la inoculación del patógeno, esta actividad se mantuvo elevada al día 2. Se observó una disminución de la actividad al nivel del testigo partir del día 3, y se mantuvo el día 5. Se observó una disminución significativa el día 7 y nuevamente un aumento al nivel del testigo al día 9. Por su parte, en las plántulas tratadas con inulina e infectadas con P. capsici (IP) se observó un aumento en su actividad a partir del día de la inoculación del patógeno, que se mantuvo al día 1. Esta actividad disminuyó al nivel del testigo al día 2 y aumentó de manera significativa al día 3. Se observó una disminución al nivel del testigo al día 5 y una disminución significativa al día 7, para aumentar al nivel del testigo al día 9. La inulina fue capaz de aumentar la actividad de peroxidasas de manera sistémica en las plántulas infectadas con P. capsici, y de manera diferenciada con respecto a las plantas sin tratamiento. Las plántulas tratadas con inulina de dalia presentaron un aumento en la actividad de peroxidasas a nivel local y sistémico, que se asoció con la inducción de una respuesta de defensa efectiva contra la infección de P. capsici.
Inducción de la producción de compuestos fenólicos. En este estudio se asoció el contenido de los compuestos fenólicos totales con la producción de fitoalexinas.
Evaluación de la actividad peroxidasas en raíces (a) y en hojas (b) de plántulas de chile. Los tratamientos se describen en la figura 2. Las líneas verticales representan la desviación estándar. Los asteriscos representan diferencias significativas con respecto al testigo.
Respecto a la respuesta local, las plántulas infectadas con P. capsici (P) no presentaron diferencias significativas con el control (C) en los días evaluados (Figura 4a). Por su parte, en las plántulas tratadas con inulina e infectadas con P. capsici (IP) solo presentaron un aumento significativo en el contenido de los compuestos fenólicos a los 5 días después de la inoculación del patógeno, y una disminución importante al día 7.
Por otra parte, se observó una respuesta sistémica en las hojas de las plántulas de chile (Figura 4b). El contenido de compuestos fenólicos en las plántulas infectadas con P. capsici (P) disminuyó de manera significativa al día 2 después de la inoculación del patógeno, después se observó un aumento hasta el nivel del testigo al día 3 que se mantuvo durante los demás días evaluados. Por su parte, en las plántulas tratadas con inulina e infectadas con P. capsici (IP) se observó el mismo comportamiento que las plántulas infectadas con respecto al testigo. Sin embargo, se observaron diferencias significativas entre las plántulas infectadas (P) y las tratadas con inulina (IP). Se observó un aumento significativo del contenido de compuestos fenólicos en el día 5 y una disminución en el día 7. La inulina indujo una respuesta sistémica diferenciada del contenido de compuestos fenólicos totales en las plántulas infectadas con P. capsici.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio se asoció el aumento en los niveles de actividad enzimática y las diferencias significativas observadas en el contenido de compuestos fenólicos a nivel local y sistémico como un tipo de respuesta de defensa inducida efectiva por la inulina contra la infección de P. capsici en chile serrano.
Discusión
La producción de chile verde en México tiene gran importancia económica. Sin embargo, este cultivo es susceptible a hongos y oomicetos que pueden causar pérdidas económicas considerables (Pérez-Acevedo et al., 2017). Para su control, se emplean productos químicos que son costosos y con altas probabilidades de generar resistencia a largo plazo, la búsqueda de alternativas para el manejo de estos fitopatógenos es de gran importancia. El potencial de la inulina como un inductor de defensa vegetal surgen como una alternativa para incluirse en el manejo integral de dichas enfermedades, considerando su disponibilidad, bajo costo y nula toxicidad, además de tener un efecto indirecto que disminuye las probabilidades de la generación de resistencia. Previamente se ha descrito el efecto de protección contra la infección de P. capsici en chile con la aplicación de inulina, disminuyendo la incidencia y síntomas de la enfermedad a una sola concentración de 200 μM (López-Velázquez et al. 2019a, 2019b). El mecanismo de esta protección se ha
Cuantificación de compuestos fenólicos totales en raíces (a) y en hojas (b) de plántulas de chile. Los tratamientos se describen en la <xref ref-type="fig" rid="f2">Figura 2</xref>. Las líneas verticales representan la desviación estándar. Los asteriscos representan diferencias significativas con respecto al testigo.
asociado a la inducción de la defensa efectiva en la planta. Sin embargo, no se había comprobado este efecto de inducción de defensa vegetal en chile.
En este estudio se observó que una concentración entre 100 a 300 μM de inulina tuvo un efecto protector contra la infección de P. capsici, observándose una disminución de la severidad de la enfermedad e incidencia, así como una fluctuación sobre el peso fresco y la altura de la planta. Adicionalmente, se observó la disminución de la viabilidad de la raíz de las plantas tratadas con inulina y las plantas infectadas con el patógeno. Esta disminución de la viabilidad no afectó su crecimiento y se observó que el volumen radicular puede llegar a ser mayor que el control. Mientras que, en la planta infectada el volumen radicular es significativamente menor y puede asociarse con daño significativo en el crecimiento de la raíz.
Se desencadenan diferentes tipos de respuestas que están relacionadas con la protección de las plantas, incluyendo la activación de las proteínas PR y la producción de fitoalexinas, sus fluctuaciones y cambios en los niveles de actividad y acumulación de metabolitos en comparación con las plantas enfermas, se consideran como una respuesta de defensa efectiva contra el patógeno. De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó que la aplicación de inulina indujo un aumento en la actividad de enzimas β-1,3 glucanasas a nivel local y sistémico. Esto concuerda con los resultados descritos para otros oligosacáridos con actividad de elicitores. Sajeesh (2015), reportó la inducción de enzimas defensivas, entre ellas β-1,3 glucanasas, mediante la aplicación de quitosano, un oligosacárido derivado de la quitina y ampliamente reportado en la defensa de plantas, esta respuesta se observó en el control de Phytophthora infestans en papa (Solanum tuberosum).
Por otra parte, se han reportado a los fructooligosacáridos Burdock (BFO) como inductores de una respuesta de defensa efectiva. Zhang et al. (2009) aplicaron de manera foliar BFO en pepino (Cucumis sativus) y posteriormente inocularon el patógeno Colletrotrichum orbiculare bajo condiciones de invernadero; observaron que a los 6 días después de la inoculación del patógeno, un aumento significativo en la actividad de β-1,3 glucanasas tanto en las hojas tratadas con BFO consideradas locales, como en las que no fueron tratadas con BFO, consideradas como sistémicas, en contraste con las hojas sin tratamiento e inoculadas con C. orbiculare. Esto fue equivalente a lo observado en este estudio, donde se incrementó la actividad de β-1,3 glucanasas en las plantas tratadas con inulina e inoculadas con P. capsici. En este mismo estudio observaron un incremento en la respuesta local y de menor intensidad en la respuesta sistémica. En este estudio, con inulina, se observó que la respuesta local y sistémica de la actividad de β-1,3-glucanasas fueron semejantes. En este mismo sentido, Sun et al. (2013) reportaron el aumento de la actividad de β-1,3 glucanasas y protección a la infección de Botrytis cinerea con la aplicación postcosecha de BFO en uva de Kyoho (Vitis vinifera ‘Kyoho’). La actividad aumentó en los primeros días después de la inoculación del patógeno (días 1, 2 y 3) para disminuir posteriormente en los días 4 y 5. En este estudio, la actividad de β-1,3 glucanasas a nivel local presentó un comportamiento similar, aunque el aumento fue a partir del día 2 y la disminución hasta el día 9. Una diferencia importante con respecto a lo reportado en la literatura es que los polímeros son aplicados a nivel foliar, mientras que este estudio fue a la base de la planta.
Otro grupo de proteínas PR evaluadas en este estudio fueron las peroxidasas. Se ha descrito que algunos carbohidratos con actividad de elicitores inducen la actividad de peroxidasas (Chaliha et al., 2018), y su activación también se ha asociado a una respuesta de defensa efectiva en cultivares de chile resistentes a P. capsici (Wang et al., 2013). La inducción de la actividad de peroxidasas asociado a una respuesta de defensa efectiva por carbohidratos con actividad de elicitores ha sido descrita para diferentes patosistemas (Chaliha et al., 2018). Zhang et al. (2009) reportaron la aplicación foliar de los fructooligosacáridos Burdock (BFO) en pepino y posterior inoculación del patógeno C. orbiculare bajo condiciones de invernadero observaron que a los 6 días después de la inoculación del patógeno, se presentó un aumento significativo en la actividad de enzimas con actividad de peroxidasas, incluyendo superóxido dismutasa (SOD) y polifenol oxidasa (PPO). Asimismo, observaron un mayor incremento en la respuesta local y una menor intensidad en la respuesta sistémica. En este estudio se observó un comportamiento similar para las plantas tratadas con inulina. Otro carbohidrato que se ha reportado como inductor de defensa vegetal es la trehalosa, que fue capaz de inducir la activación de peroxidasas en trigo (Triticum aestivum) para contrarrestar a Blumeria graminis (Reignault et al., 2001). Se describió un aumento en la actividad de peroxidasas a nivel local a partir del día 2 después de la inoculación del patógeno en plantas tratadas con trehalosa, una respuesta que corresponde con lo observado en este estudio.
Finalmente, se evaluó la inducción de fitoalexinas en las plántulas de chile a partir de los tratamientos con inulina. En este estudio se asoció el contenido de los compuestos fenólicos totales con la producción de fitoalexinas (Yu et al., 2022). Se ha reportado la producción de fitoalexinas inducidas por trehalosa en trigo para el control de B. graminis, asociadas con la activación de la fenilalanina amonioliasa (PAL) un día después del tratamiento (Reignault et al., 2001). En contraste, Sun et al. (2013) reportaron la disminución del contenido de fenoles totales con la aplicación postcosecha de BFO en uva de kyoho en la infección de B. cinerea. En este estudio, el aumento en el contenido de compuestos fenólicos totales por el tratamiento con inulina a nivel local fue mínimo y no se podría asociar con una respuesta de defensa efectiva. A nivel sistémico, se pudo observar una respuesta diferenciada entre las plantas infectadas y las tratadas con inulina, que permitió monitorear los cambios en el contenido de los compuestos fenólicos totales. Sin embargo, aún hace falta asociar estos cambios con una respuesta efectiva contra la infección de P. capsici.
En este estudio se pudo asociar una protección por la aplicación de la inulina de dalia como un efecto de inducción de defensa vegetal o también denominada como elicitor (Bektas y Eulgem 2015). Las plantas tratadas con la inulina presentaron un aumento en los niveles de actividad de β-1,3 glucanasas y peroxidasas a nivel local y sistémico contrastantes con las plantas infectadas con P. capsici y el testigo. El uso de fructooligosacáridos en la agricultura como inductores de defensa vegetal representa un área de oportunidad y con gran potencial. Se han descrito algunos trabajos relacionados con la protección vegetal de otros fructooligosacáridos como los fructanos de agave en chile que dependen del grado de polimerización para aumentar o disminuir la protección (Navarro-Lopez et al, 2019), aunque sin determinar si la protección fue por inducción de defensa vegetal. En el caso de la inulina, será importante evaluar si esta protección puede modificarse de manera positiva dependiendo de sus propiedades fisicoquímicas, origen o pureza, lo que facilitaría su uso y transferencia tecnológica al disminuir los costos de producción, aprovechando su inocuidad, solubilidad y estabilidad en su almacenaje (Leyva-Porras et al., 2014).
Conclusiones
La inulina de tubérculos de dalia presentó un efecto protector contra la infección de Phytophthora capsici, a concentraciones que oscilan de 100 a 300 μM, al disminuir la incidencia y los síntomas de la enfermedad. Esta protección fue asociada a la inducción de una respuesta de defensa efectiva, con un aumento de la actividad de las enzimas β-1,3 glucanasas y peroxidasas a nivel local y sistémico. Esta respuesta fue diferenciada entre las plántulas tratadas con inulina y las plántulas infectadas con P. capsici. A partir de estos resultados, se propone el uso de la inulina de dalia como un agente protector contra la infección de P. capsici en chile serrano.
Agradecimientos
El primer autor agradece al Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías por la beca otorgada, con número 61044 para estudios de la Maestría en Ciencias en Innovación Biotecnológica realizada en el Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco.
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Avance de siembras y cosechas, resumen por estado. http://infosiap.siap.gob.mx:8080/agricola_siap_gobmx/ResumenProducto.do (consulta, Diciembre, 2023). SADER, Secretaría de Agricultura y Desarrollo Rural2023Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera. Avance de siembras y cosechas, resumen por estadohttp://infosiap.siap.gob.mx:8080/agricola_siap_gobmx/ResumenProducto.do Sun, F. , Zhang, P. , Guo, M. , Yu, W. , Chen, K. (2013). Burdock fructooligosaccharide induces fungal resistance in postharvest Kyoho grapes by activating the salicylic acid-dependent pathway and inhibiting browning. 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Objective / Background.
Phytophthora capsici is the causal agent of chili wilt. Among the strategies for its control is the use of resistance inducers. Fructans are molecules with interesting biological properties, including the ability to induce resistance mechanisms in some plants. In this work, the protective effect of four concentrations inulin from dahlia tubers on chili infected with P. capsici was evaluated.
Materials and Methods.
The concentration that showed the highest protection was chosen to evaluate the induction of defense response through the enzymatic activity of β-1,3 glucanases, peroxidases and the production of total phenolic compounds.
Results.
Inulin showed a protective effect against infection at concentrations of 100 to 300 μM, as symptoms decreased and seedlings showed improved vegetative development. It was observed that inulin at 200 μM concentration was able to induce an effective defense response associated with increased activity of β-1,3 glucanases and peroxidases through a local and systemic response in seedlings. This response was differentiated between seedlings treated with inulin and seedlings infected with
P. capsici.
Conclusion.
It was concluded that inulin has the ability to protect chili bell pepper from P. capsici by induction of resistance.
Chili (Capsicum annuum) es an economically important crop in Mexico, with a production estimated in over 3.1 million tons a year, making Mexico the fourth chili producer in the world in 2022 (SADER, 2023). However, this crop is affected by different pathogens including viruses, bacteria, oomycetes and fungi, which cause metabolic alterations in the crop, limiting the yield and quality of the fruit (Ramos- Sandoval et al., 2010; Majid et al., 2017). Chili wilting or blight, considered the most destructive disease for the crop (Barchenger et al., 2018), is mainly related to the oomycete Phytophthora capsici, which spreads through irrigation and rain water via oospores and zoospores (Sanogo et al., 2023). Economic losses related to this disease are considered of great importance for farmers, and its control entails a considerable rise in crop production costs (Moreira-Morrillo et al., 2022).
In Mexico, diverse studies have been carried out on the presence, genetic diversity and search for chili varieties resistant to this pathogen (Castro-Rocha et al., 2016; Palma-Martínez et al., 2017; Pons-Hernández et al., 2020). Isolations have been obtained in different chili species and varieties from production areas in Aguascalientes, Chihuahua, Guanajuato, Jalisco and Michoacán, as well as characterizing the distribution of the pathogen and its range of hosts in economically important crops of the Solanaceae and Cucurbitaceae families (Reyes-Tena et al., 2021).
Different alternatives are explored to control chili wilting, such as resistance inducers or plant defense, which may be peptides, polysaccharides, lipids and other types of biomolecules. Its action mechanism is the generation of an induced defense response, or “priming”, which includes physiological, molecular or epigenetic changes as a result of a stimulus related to a process of pathogenesis, where the plant generates a resistance response, which protects it against the later attack of pathogens (Hönig et al., 2023).
Different molecules have been reported as resistance inducers against the genus Phytophthora. From phytohormones such as jasmonic acid and methyl jasmonate, which were proven to delay the progress of the infection by P. infestans in potato (Arévalo-Marín et al., 2021) to low-spectrum fungicides such as potassium phosphite, a functional analog of salicylic acid such as acibenzolar-S-methyl and a non-protein amino acid such as β-aminobutyric acid (BABA) that reduced the lesions and symptoms of the disease related to P. infestans in tree tomato (Solanum betaceum) (Castaño-Monsalve et al., 2015).
The genus Dahlia includes perennial herbaceous plants that are characterized by their inflorescences with ligulate and discoid flowers, tuberous roots, developed from a short rhizome. This genus has 38 species, out of which 35 are endemic to Mexico (Carrasco-Ortiz et al., 2019). The main use of the dahlia is as an ornamental plant, although its medicinal and nutritional benefits are currently being promoted. Particularly the tuberous roots are characterized for their fiber, protein, mineral and vitamin contents, as well as for their percentage of carbohydrates in the form of inulin and other fructans (Hernández-Epigmenio et al., 2022). Depending on the maturity of the root and on the species, the inulin content may fluctuate between 52 and 83 % of de carbohydrates found in the tubers (Santana-Legorreta et al., 2016). In this sense, fructans are polymers composed of fructose units linked by β(2-and/or β(2-6) bonds that generally have a terminal glucose residue, and some derivatives have been reported as inducers of plant defense for some crops (Sun et al., 2013; Zhang et al., 2009; Zhang et al., 2013). For the chili crop (C. annuum), the use of agave (Agave tequilana var. Azul) fructans have been reported, with different degrees of polymerization and concentrations inducing a protective effect against the severe symptoms of infection by P. capsici, reducing the incidence and damage to the root through foliar application (Navarro-López et al., 2019). Applying inulin (200 µM) on the base of the chili plant has also been reported to reduce the incidence of the disease and the damage on the root caused by P. capsici by up to 40 % (López-Velázquez et al., 2019a). This protection by inulin could have been increased by up to 80 % with the use of biodegradable hydrogels that protected the polymer in from lixiviation and degradation in the soil (López- Velázquez et al., 2019b). In all three studies, the protection against the disease was evaluated with the reduction of the incidence, damage to the roots, and the presence of the pathogen in the root, although no tests were conducted to determine if this protection was triggered by the induction of resistance in the plant.
Considering the importance of validating that the protection provided by the application of inulin is related with the induction of plant defense mechanisms, as well as the effects of different doses of the polymer, the aim of this study was to evaluate the protective effect of four concentrations of a reactive grade of inulin from dahlia tubers applied on the base of the plant. The concentration that displayed the greatest protection was further assessed for its induction of an effective biochemical defense response through the enzymatic activity of β-1,3 glucanases, peroxidases and the production of total phenolic compounds.
Materials and Methods
Location and area of study. This study was carried out in the facilities of the Plant Biotechnology Unit of the Center for Research and Assistance in Technology and Design in the state of Jalisco AC. Zapopan Unit, between August and December, 2018.
Plant material. Serrano chili seeds (Capsicum annuum) cv. Camino Real (Harris Moran Seed Company) were used. They were disinfested by submerging for 3 minutes in commercial sodium hypochlorite (NaClO) at 3%. Next, they were rinsed with distilled water and left to germinate on trays with a sterile peat-moss substrate, sand and vermiculite in a proportion of 6:2:1, respectively.
Biological material. The Phytophthora capsici (CH11) strain from the CIATEJ strain collection was used, provided and isolated in 2011 by Dr. Sylvia Fernández Pavía, of the Institute of Agricultural and Forestry Research of the San Nicolás de Hidalgo University of Michoacan (Reyes-Tena et al., 2019). The conditions for planting and generation of the inoculum were the same as those described by López-Velázquez et al. (2019a) .
Clarified v8 culture medium. V8 (Campbell’s) juice was used, clarified by filtration. A mixture was prepared using 50 mL of clarified juice, 0.5 g of calcium carbonate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and 15 g of agar (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) in distilled water. This mixture was shaken and diluted to 1 L with distilled water. The medium was sterilized using an autoclave at 121 °C for 20 min (Trinidad-Cruz et al., 2021).
Dahlia tuber inulin solutions. Inulin solutions were prepared from reactive grade inulin from dahlia tubers (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). They were dissolved in distilled water at concentrations of 20, 100, 200 y 300 μM. The solution was sterilized by filtration with 20 μm membranes before their application.
Evaluation of the protection of dahlia inulin in the control of P. capsici. Ten 30-day old chili seedlings were used per treatment, which were transplanted in 275 mL polystyrene cups with a sterile substrate composed of peat-moss, sand and vermiculite in a proportion of 6:2:1. After transplanting, 10 mL of dahlia tuber inulin were placed on the base of the stem. Inulin concentrations were 20, 100, 200 and 300 μM. Ten days after applying the inulin, a second application was performed, and immediately after that, the seedlings were inoculated with 10 mL of the P. capsici zoospore suspension (1×104 zoospores mL-1) (Wang et al., 2013). The experiment ended two weeks after inoculation, photographs were taken to record and the heights and fresh weights of the plants were determined. The level of protection against the disease was also determined, considering the following disease severity scale that was proposed based on the symptoms observed throughout the experiment: 1. Healthy seedling, with no evident signs of the disease; 2. Seedling with chlorosis, darkening in stem and roots, wilting in leaves; 3. Seedling displaying damage on leaves, necrosis in stem and roots, short roots, severe defoliation and smaller size than the control and 4. Dead seedling. A randomized block experimental design was used with 10 repetitions each. The seedlings taken as controls were the ones provided with sterile distilled water instead of inulin and the plants inoculated with only the pathogen. The experiment was carried out in duplicate, separated in space and at the same time.
Determining damage in roots. To determine the damage on the roots, the viability of roots was compared between different treatments. The viability was determined with the reduction of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) to 1,3,5-triphenylformazan (TTF) using the method described by Wang et al. (2013) with some modifications (López-Velázquez et al., 2019a). The viability of the roots was obtained by calculating the intensity of the reduction of the TCC (mg g-1 h) = absorbance of the reduced TTC / FW h, where FW is the mass of the fresh root and h is the time of incubation.
Presence of the oomycete in the root. The presence of the oomycete in the root of the chili plant was determined by staining the mycelium with trypan blue (López- Velázquez et al. 2019b). Root samples were taken and bleached with potassium hydroxide at 1.7 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) and hydrogen peroxide at 0.5 M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). They were they dyed using trypan blue at 100 μM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) for 2 h. The excess dye was discarded by washing with lactoglycerol and the samples were observed under an optic microscope (Olympus, model BH-2, Tokyo, Japan).
Evaluation of the induction of response by defense in chili from the treatment with dahlia inulin against P. capsici. Thirty-day old seedlings were used, which were transplanted into 1 kg polyethylene bags with a sterile substrate. After transplanting, 10 mL of dahlia tuber inulin were applied on the base of the seedling, in the concentration that displayed the greatest protection (200 μM); a treatment with inulin and the oomycete was considered, along with another one, only with the pathogen, and finally, a treatment with distilled water as a control. Ten days after the first application of the inulin, a second application was made, followed immediately by an inoculation of the plant with 10 mL of the P. capsici (1×104 zoospores mL-1) zoospore suspension (Wang et al., 2013).
Enzyme extraction and activity trials. Root and leaf samples were taken from the plant at the moment of induction, on the day of inoculation with the pathogen (considered day 0) and 1, 2, 3, 5, 7 and 9 days after inoculation with the pathogen. The enzyme activity was determined for proteins related to pathogenesis (PR) with the activities of β-1,3 glucanases and peroxidases. The production of phytoalexins was related with the quantification of total phenolic compounds absorbed at 650 nm. The samples were macerated with liquid nitrogen. To determine the β-1,3 glucanases and peroxidases, they were resuspended in a sodium phosphate 0.1 M buffer with a pH 7.0. To quantify the total phenolic compounds, they were resuspended in methanol al 80 % (v/v).
Determining the activity of β-1,3 glucanases. This was carried out with the colorimetric method to detect reducing sugars at 515 nm, as a result of enzymatic hydrolysis and reduction of DNS (3,5-dinitrosalicylic acid, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Quantification was carried out using a calibration curve with glucose, and the specific activity was reported in nanokatals (nkat) per gram
(g) of total protein (nkat g-1 g-1 TP). One nkat is defined as 1 nmol of D-glucose released from laminarin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) per second under the conditions of the test (Oliveira et al., 2014).
Determining the activity of peroxidases (POX). This was carried out following the method proposed by Oliveira et al. (2014). We used 10 µL of leaf and root extract for the reactions. The variation of one unit of absorbance per minute was defined as a unit of peroxidase activity (1 AU) and expressed per gram of total protein (AU g-1 g-1 TP).
Determining the induction of total phenolic compounds. This was determined by quantifying total phenolic compounds, following the method proposed by Ainsworth and Gillespie (2007), with some modifications (López-Velázquez et al., 2019a). The quantification was carried out using a standard curve of known concentrations of catechol (0.2 - 1 mM) and the results were expressed as nmol catechol g -1 FW-1.
Statistical analysis. The data were normalized with the Anderson-Darling test. Later, a unifactorial analysis of variance was carried out, using the procedures from the Statgraphics Centurion XVI, version 16.1.11 statistical package (Statistical Graphics, Englewood Cliffs, NJ, USA). For the separation between means, an analysis was performed using the LSD test, with a level of significance of 95 %.
Results
Protection of dahlia inulin in the control of the infection by P. capsici in chili. To determine the degree of protection against the infection from P. capsici by the application of dahlia inulin in serrano chili plants, different parameters were evaluated, such as the reduction of the symptoms of the disease, including the height and fresh weight of the seedling, incidence of the disease, as well as the damage, viability and the presence of the pathogen in the root. The results of the biological effectiveness test showed that plants inoculated with the pathogen (P) had a disease incidence of 80 %, a level 4 disease severity and severe damage to the root, observed as a significantly lower root volume than the control (C) (Figure 1). In addition, a significant reduction was observed in the fresh weight and height of the plant, as well as the viability of the root regarding the control group (Table 1). For the seedlings treated with 20 μM of inulin (I1+P), there was no protection induction response and the symptoms, incidence, disease severity and damage to root were similar to what was observed in plants infected with P. capsici (Figure 1a). The same effect was observed for fresh weight, plant height and root viability (Table 1). The treatment with 100 μM of inulin (I2+P) displayed a positive effect in the induction of protection against the infection by P. capsici. With this treatment, the disease incidence shown was 50 %, severity was rated as level 3 and no significant damage was found in the root (Figure 1b). The fresh weight and seedling height were equivalent to those of the control, although root viability was equal to that of the infected seedlings (Table 1). For the seedlings treated with 200 μM of inulin (I3+P), the induction of the protection against the infection of P. capsici was also observed, although with a severity of level 2 and an incidence of 40 %, being the best protection observed in all treatments (Figure 1).
Finally, the seedlings treated with 300 μM of inulin (I4+P) displayed the induction of protection. Incidence was reduced by 50 %, disease severity was level 3 and no damage was observed in the root (Figure 1). The fresh weight and height of the plant were equivalent to the control, although the viability of the roots was equivalent to that in the infected plants (Table 1). In all the treatments inoculated with the pathogen, the infection was verified with the presence of the P. capsici mycelium, which indicates that the oomycete was able to colonize the roots (Figure 1c). The results highlight that the viability pero mg of the roots from plants treated with inulin did not display significant differences with the plants infected with P. capsici (Table 1). From these results, the treatment with 200 μM of inulin (I3+P) was considered as the one that induced the best protection against the infection by P. capsici in chili plants. This concentration was used for the evaluations of the induction of an effective defense response in chili.
Defense induction in chili seedlings with the application of dahlia inulin against P. capsici
Activity of β-1,3 glucanasas. The response in the root was considered a local defense response and the response in leaves was considered a systemic defense response. In
Evaluation of dahlia inulin in the protection of <italic>P. capsici</italic> infection in chili seedlings. a: Biological effectiveness test of dahlia inulin in chili seedlings, bar equivalent to 10 cm; b: Root damage, bar equivalent to 5 cm; c: Presence of the oomycete in chili roots, bar equivalent to 20 µm, arrows indicate oomycete presence. Treatments as follows: C: Control seedlings, treated with only sterile distilled water; P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic>; I1+P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic> and treated with 20 μM of inulin; I2+P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic> and treated with 100 μM of inulin; I3+P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic> and treated with 200 μM of inulin; I4+P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic> and treated with 300 μM of inulin.
Growth parameters and protection induced by dahlia inulin in chili seedlings.
Treatment
Fresh weight (g)
Height of the seedlings (cm)
Root viability (mg g-1 h WF)
Disease severity
Disease incidence (%)
C
1.8 ± 0.27a
27.7 ± 0.66a
1.7 ± 0.11 c
1
0
P
0.8 ± 0.18a
22.5 ± 2.04a
0.9 ± 0.20a
4
80
I1+P
0.7 ± 0.18a
22.1 ± 0.89a
0.9 ± 0.09ab
4
80
I2+P
1.3 ± 0.18a
26.3 ± 1.06a
1.0 ± 0.16ab
3
50
I3+P
1.8 ± 0.37bc
26.9 ± 1.54a
0.9 ± 0.35ab
2
40
I4+P
1.5 ± 0.23bc
28 ± 1.2a
0.6 ± 0.03a
3
50
The treatments are described in figure 1. Means with different letters differ by LSD test for p<0.05.
leaves and roots, the statistical analysis displayed significant differences between treatments and samplings (p < 0.05). Regarding the local response (Figure 2a), the activity of β-1,3 glucanases in seedlings infected with P. capsici (P) increased significantly in regard to the control until day 5 after the inoculation of the pathogen. This activity remained high on day 7 and dropped to the level of the control on day 9. In turn, seedlings treated with inulin and infected with P. capsici (IP) displayed an increase in activity starting on day 2 after the inoculation of the pathogen and remained high until day 7, followed by a significant reduction of activity on day 9. The dahlia inulin was able to locally and prematurely increase the activity of β-1,3 glucanases in the plants inoculated with P. capsici.
Regarding the systemic response, changes were observed in the activity of β-1,3 glucanases on the leaves of treated seedlings (Figure 2b). The activity of β-1,3 glucanases in infected plants (P) increased significantly in regard to the control starting on day 2 after the inoculation of the pathogen. This activity dropped to the level of the control on day 3, remaining on that level on day 5, dropping significantly on day 7 and finally increasing on day 9. On the other hand, in seedlings infected and treated with inulin (IP), the increase in activity was observed starting on the day of inoculation with the pathogen, which remained on days 1, 2, 3 and 5. A reduction was observed that reached the level of the control on day 7, and another significant increase took place on day 9. The dahlia inulin was able to cause a systemic and early increase in the activity of β-1,3 glucanases, in the plants inoculated with P. capsici.
Activity of peroxidases. This study evaluated the activity of enzymes with activity of peroxidases in leaves and roots in chili plants inoculated with P. capsici and treated with dahlia inulin. In regard to the local response, a statistical difference was observed between samplings and treatments (p < 0.05) (Figure 3a). The activity of peroxidases in the seedlings infected with P. capsici (P) fell significantly
Evaluation of β-1,3 glucanase activity in roots (a) and leaves (b) of chili seedlings treated with dahlia inulin and inoculated with <italic>P. capsici</italic>. C: Control seedlings, treated with sterile distilled water; P: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic>; I: Seedlings treated with 200 μM of inulin; IP: Seedlings inoculated with <italic>P. capsici</italic> and treated with 200 μM of inulin. The vertical lines represent the standard deviation. Asterisks represent significant differences with respect to the control.
Evaluation of peroxidase activity in roots (a) and leaves (b) of chili seedlings. The treatments are described in figure 2. The vertical lines represent the standard deviation. Asterisks represent significant differences with respect to the control.
on day 2 after the inoculation of the pathogen. This activity remained low, although with levels near to those for the control on days 3 and 5. A significant increase was observed on day 7, along with a new reduction of the control on day 9. In turn, in seedlings treated with inulin and infected with P. capsici (IP), an increase in activity was observed starting on the day of inoculation of the pathogen. This activity decreased to the same level as the control starting on day 1 and remained at this level until day 2. A significant reduction in activity was observed until day 3, as well as a significant increase starting on day 5, which remained on days 7 and 9. The inulin was able to cause a local and early increase in the activity of peroxidases in plants infected with P. capsici.
A systemic response was observed when changes took place in the activity of peroxidases in the leaves (Figure 3b). The activity of peroxidases in seedlings infected with P. capsici (P) increased significantly on day 1 after the inoculation of the pathogen and remained elevated on day 2. A reduction in activity was observed to the level of the control starting on day 3, and remained unchanged on day 5. A significant reduction was observed on day 7, followed by an increase to the same level as the control on day 9. In turn, an increase was observed in the activity of the seedlings treated with inulin and infected with P. capsici (IP), starting on the day of inoculation of the pathogen, which remained stable on day 1. This activity dropped to the same level as the control on day 2, and increased significantly on day 3. A reduction to the level of the control was observed on day 5, followed by a significant reduction on day 7, to then rise to the level of the control on day 9. The inulin was able to increase the peroxidase activity systemically in seedlings infected with P. capsici, and in a differentiated manner compared to untreated plants. Seedlings treated with dahlia inulin displayed an increase in peroxidase activity at both local and systemic levels, which was related to the induction of an effective defense response against infection by P. capsici.
Induction of the production of phenolic compounds. This study related the content of the total phenolic compounds with the production of phytoalexins. Regarding the local response, the seedlings infected with P. capsici (P) displayed no significant differences with the control (C) in the days evaluated (Figure 4a). On the other hand, the seedlings treated with inulin and infected with P. capsici (IP) only displayed a significant increase in the content of phenolic compounds 5 days after the inoculation of the pathogen, and an important reduction on day 7.
On the other hand, a systemic response was observed in the leaves of the chili seedlings (Figure 4b). The content of phenolic compounds in the seedlings infected with P. capsici (P) fell significantly on day 2 after the inoculation of the pathogen, followed by an increase was observed to reach the level of the control on day 3, where it remained for the rest of the days evaluated. On the other hand, the seedlings
Quantification of total phenolic compounds in roots (a) and leaves (b) of chili seedlings. The treatments are described in <xref ref-type="fig" rid="f6">Figure 2</xref>. The vertical lines represent the standard deviation. Asterisks represent significant differences with respect to the control.
treated with inulin and infected with P. capsici (IP) displayed the same behavior as the plants infected in regard to the control. However, significant differences were observed between the infected seedlings (P) and those treated with inulin (IP). A significant increase was found in the content of phenolic compounds on day 5 and a reduction on day 7. Inulin induced a systemic response, differentiated from the content of total phenolic compounds in the seedlings infected with P. capsici.
According to the results of this study, the increase in the levels of enzymatic activity and the significant differences in the content of phenolic compounds observed locally and systemically was related as a type of effective defense response induced by inulin against infection by P. capsici in serrano chili.
Discussion
The production of green chili in Mexico is an activity of great economic importance. However, this crop is susceptible to fungi and oomycetes that can cause considerable economic losses (Pérez-Acevedo et al., 2017). In order to control them, costly chemical products are used that also have high probabilities of creating long- term resistance, therefore the search for alternatives for the management of these phytopathogens is of great importance. The potential of inulin as an inducer of plant defense is an alternative to be included in the comprehensive management of such diseases, considering its availability, low cost and null toxicity, as well as having an indirect effect that reduces the probability of creating resistance. The effect of protection against infection by P. capsici in chili with the use of inulin, reducing the incidence and symptoms of the disease with one single concentration of 200 μM (López-Velázquez et al. 2019a, 2019b) has been described above. The protection mechanism has been associated with the induction of the effective defense in the plant. However, this plant defense induction effect had not yet been proven in chili plants.
This study observed that a concentration between 100 and 300 μM of inulin had a protective effect against the infection by P. capsici, displaying a reduction in the severity and incidence, as well as a fluctuation on the fresh weight and height of the plant. Additionally, the viability of the root of the plants treated with inulin and the plants infected with the pathogen were reduced. This reduction in viability did not affect plant growth and it was observed that the volume of the root may be larger than in the control. Meanwhile, in the infected plant the root volume is significantly lower and may be related to the significant damage to the root growth.
Different types of responses are triggered, which are related to the protection of the plant, including the activation of the PR proteins and the production of phytoalexins. Its fluctuations and changes in the levels of activity and the accumulation of metabolites in comparison with diseased plants are considered an effective defense response against the pathogen. According to the results of this study, the use of inulin induced an increase in the activity of enzymes β-1,3 glucanases at a local and systemic level. This coincides with the results described for other oligosaccharides with elicitor activity. Sajeesh (2015) reported the induction of defensive enzymes, including β-1,3 glucanases, with the application of chitosan, an oligosaccharide derived from chitin and widely reported in the defense of plants. This response was observed in the control of Phytophthora infestans in potato (Solanum tuberosum).
On the other hand, Burdock fructooligosaccharides (BFO) have been reported as inducers of an effective defense response. Zhang et al. (2009) applied BFO on the leaves of cucumber plants (Cucumis sativus) and later inoculated the pathogen Colletrotrichum orbiculare under greenhouse conditions. Six days after the inoculation of the pathogen, they noticed a significant increase in the activity of β-1,3 glucanases, both in the leaves treated with BFO considered locals, and in those not treated with BFO considered systemic, as opposed to the untreated leaves and inoculated with C. orbiculare. This was equivalent to the observations made in this study, where the activity of β-1,3 glucanases increased in plants treated with inulin and inoculated with P. capsici. In this same study, an increase was observed in the local response, and in less intensity, in the systemic response. In this study, with inulin, the local and systemic responses of the activity of β-1,3-glucanases were found to be similar. In this sense, Sun et al. (2013) reported the increase in the activity of β-1,3 glucanases and protection against the infection of Botrytis cinerea with the postharves application of BFO in grapes in Kyoho (Vitis vinifera ‘Kyoho’). The activity increased in the first days after inoculating the pathogen (days 1, 2 and 3), to later decrease in days 4 and 5. In this study, the local activity of β-1,3 glucanases presented a similar behavior, although the increase began on day 2 and reduction, until day 9. An important difference with reports found in the literature is that polymers are applied on leaves, whereas in this study, they were applied on the base of the plant.
Another group of PR proteins evaluated in this study were peroxidases. Some carbohydrates with eliciting activity have been described to induce the activity of peroxidases (Chaliha et al., 2018), and their activation has also been associated to an effective defense response in chili plants resistant to P. capsici (Wang et al., 2013). The induction of the activity of peroxidases associated to an effective defense response by carbohydrates with elicitor activity has been described for different pathosystems (Chaliha et al., 2018). Zhang et al. (2009) reported the foliar application of the Burdock fructooligosaccharides (BFO) on cucumber, followed by the inoculation of the pathogen C. orbiculare under greenhouse conditions. They noticed that 6 days after the inoculation of the pathogen there was a significant increase in the activity of enzymes with activity of peroxidases, including superoxide dismutase (SOD) and polyphenol oxidase (PPO). Likewise, they observed a greater increase in the local response and a lower intensity in the systemic response. This study observed a similar behavior for the plants treated with inulin. Another carbohydrate that has been reported as a plant defense inducer is trehalose, which was able to induce the activation of peroxidases in wheat (Triticum aestivum) to counteract Blumeria graminis (Reignault et al., 2001). An increase in the activity of peroxidases on a local level was described starting on day 2 after the inoculation of the pathogen in plants treated with trehalose, a response that corresponds with observations made in this study.
Finally, the induction of phytoalexins in chili plants was evaluated from the treatments with inulin. This study associates the content of the total phenolic compounds with the production of phytoalexins (Yu et al., 2022). The production of phytoalexins induced by trehalose in wheat has been reported for the control of B. graminis, associated with the activation of phenylalanine ammonia-lyase (PAL) one day after the treatment (Reignault et al., 2001). By contrast, Sun et al. (2013) reported the reduction of the content of total phenols with the postharvest application of BFO in kyoho grape in the infection by B. cinerea. In this study, the increase in the content of phenolic compounds due to the treatment with inulin on a local level was minimal and it could not be associated with an effective defense response. On a systemic level, a differentiated response was observed between the infected plants and those treated with inulin, which helped monitor the changes in the contents of total phenolic compounds. However, these changes still need to be related to an effective response against the infection with de P. capsici.
In this study, protection could be related with the application of dahlia inulin as an effect of the induction of plant defense, also known as an elicitor (Bektas and Eulgem 2015). The plants treated with inulin displayed an increase in the levels of activity of β-1,3 glucanases and peroxidases at both local and systemic levels, contrasting with plants infected with P. capsici and the control. The use of fructooligosaccharides in agriculture as inducers of plant defense represents an area of opportunity and with great potential. Some studies have been described as related to plant protection of other fructooligosaccharides such as agave fructans in chili, which depend on the degree of polymerization to increase or reduce protection (Navarro-Lopez et al, 2019), although without determining whether the protection was due to the induction of plant defense. In the case of inulin, it will be important to evaluate if this protection can be modified positively depending on its physicochemical properties, origin or purity, which would facilitate its use and technological transfer by reducing production costs, taking advantage of its safety, solubility and stability in storage (Leyva-Porras et al., 2014).
Conclusions
The dahlia tuber inulin displayed a protective effect against infections by Phytophthora capsici, at concentrations ranging between 100 and 300 μM, reducing the incidence and the symptoms of the disease. This protection was related to the induction of an effective defense response with an increase in the activity of the enzymes β-1,3 glucanase and peroxidase at local and systemic levels. This response was differentiated between seedlings treated with inulin and seedlings infected with P. capsici. From these results, the use of dahlia inulin is suggested as a protection agent against the infection of P. capsici in serrano chili.
Acknowledgments
The corresponding author would like to thank the Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnologías for the scholarship granted, number 61044, to study a Master’s Degree in Biological Innovation in the Center for Research and Assistance in Technology and Design in the state of Jalisco.