rmfiRevista mexicana de fitopatologíaRev. mex. fitopatol0185-33092007-8080Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C.10.18781/R.MEX.FIT.2309-2Artículo CientíficoBacillus sp. A8a reduce la marchitez por Phytophthora y modifica la acumulación de taninos en aguacateGuevara-Avendaño,Edgar1Solís-García,Itzel Anayansi1Méndez-Bravo,Alfonso2Pineda-García;Fernando3Angeles-Alvarez,Guillermo3Madero-Vega,Carolina3Pavía,Sylvia P. Fernández-4Mondragón-Flores,Alejandra5verchon*,Frédérique Re-6 Red de Estudios Moleculares Avanzados, Instituto de Ecología, A.C., Carretera antigua a Coatepec 351, Xalapa, Veracruz; México Instituto de Ecología, A.C.Instituto de Ecología, A.C.Mexico CONAHCYT-1Escuela Nacional de Estudios Superiores, Universidad Nacional Autónoma de México, Antigua Carretera a Pátzcuaro 8701, Morelia, Michoacán; México Universidad Nacional Autónoma de MéxicoUniversidad Nacional Autónoma de MéxicoMexico Red de Ecología Funcional, Instituto de Ecología, A.C., Carretera antigua a Coatepec 351, Xalapa, Veracruz; México Red de Ecología Funcional, Instituto de Ecología, A.C.Red de Ecología Funcional, Instituto de Ecología, A.C.Mexico Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales, Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo, Carretera Morelia Zinapécuaro km 9.5, Tarímbaro, Michoacán; México Universidad Michoacana de San Nicolás de HidalgoUniversidad Michoacana de San Nicolás de HidalgoMexico Campo Experimental Valle de ApatzingánINIFAP, Carretera ApatzingánCuatro caminos km 17.5, Antúnez, Michoacán; México Campo Experimental Valle de ApatzingánINIFAPCampo Experimental Valle de ApatzingánINIFAPMexico Red de Diversidad Biológica del Occidente Mexicano, Centro Regional del Bajío, Instituto de Ecología, A.C., Av. Lázaro Cárdenas 253, Pátzcuaro, Michoacán. México Centro Regional del Bajío, Instituto de Ecología, A.C.Centro Regional del Bajío, Instituto de Ecología, A.C.Mexico
Autor de correspondencia: Frédérique Reverchon frederique.reverchon@inecol.mx05102024Jan-Apr2024421RMEXFIT2309-21709202306112023Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsResumenObjetivo/Antecedentes.
El objetivo fue corroborar la capacidad como agente de biocontrol de la cepa Bacillus sp. A8a en árboles de aguacate (Persea americana) infectados por Phytophthora cinnamomi.
Materiales y Métodos.
Se implementó un experimento en invernadero con cuatro tratamientos: 1) plantas control; 2) plantas infectadas por P. cinnamomi; 3) plantas inoculadas con Bacillus sp. A8a; 4) plantas infectadas por P. cinnamomi e inoculadas con Bacillus sp. A8a. Se evaluaron distintas variables morfo-fisiológicas durante el experimento, hasta 25 días después de la infección (ddi). Además, se analizó la densidad de taninos en cortes de tallo a los 25 ddi, para determinar la respuesta de defensa de los árboles ante la enfermedad.
Resultados.
La inoculación de la cepa A8a redujo los síntomas de marchitez en un 49% a los 25 ddi, en comparación con las plantas no inoculadas. No se encontraron diferencias en las variables morfo-fisiológicas registradas entre tratamientos. Sin embargo, se detectó una mayor acumulación de taninos en el xilema de tallos de plantas infectadas, mientras que las plantas inoculadas con la cepa A8a mostraron una mayor densidad de taninos en el córtex.
Conclusión.
Nuestros resultados confirman la actividad de biocontrol de Bacillus sp. A8a en aguacate e indican que la acumulación diferencial de taninos en el córtex de plantas inoculadas con la bacteria podría contribuir a la mayor tolerancia de las plantas de aguacate ante la marchitez por Phytophthora.
México es el principal productor y exportador de aguacate (Persea americana) a nivel mundial, con una producción anual de 2,393,849 toneladas (FAOSTAT, 2020). A nivel nacional, Michoacán es el estado con mayor producción (SIAP, 2019). Sin embargo, la incidencia de plagas y enfermedades ha restringido la productividad del cultivo (TapiaRodríguez et al., 2020). Una de las enfermedades más destructivas de los huertos de aguacate a nivel global es la marchitez o pudrición de la raíz ocasionada por el oomiceto Phytophthora cinnamomi (Van den Berg et al., 2021). En México, P. cinnamomi se encuentra presente en las principales zonas productoras de aguacate con una incidencia estimada entre el 5 y el 90 %, considerándose así uno de los principales factores limitantes de la producción de este fruto (AgapitoAmador et al., 2022; MondragónFlores et al., 2022).
Phytophthora cinnamomi afecta a todas las variedades de aguacate, teniendo mayor incidencia en suelos con bajo drenaje debido a su mecanismo de infección, la cual ocurre a través de zoosporas motiles (Hardham, 2005) o de clamidosporas (Hwang y Ko, 1978). P. cinnamomi causa necrosis en las raíces finas, limitando así la adquisición de agua y nutrimentos, la marchitez a nivel foliar y, finalmente, la muerte regresiva de los árboles (Hardham, 2005). Entre las respuestas estructurales y/o bioquímicas de defensa del hospedante a la infección por P. cinnamomi, se ha reportado la acumulación de lignina o de calosa para reforzar la pared celular, la acumulación de compuestos fenólicos en raíces y la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) (van der Berg et al., 2018; Camisón et al., 2019). En otros hospedantes, las respuestas de defensa ante P. cinnamomi incluyen la acumulación de taninos (Camisón et al., 2019). Sin embargo, es necesario seguir investigando los mecanismos de defensa de variedades de P. americana ante la infección, para ampliar nuestro entendimiento de este patosistema (van der Berg et al., 2021).
Las estrategias de manejo de la marchitez por Phytophthora suelen incluir prácticas culturales encaminadas a reducir la saturación en agua de los suelos, el uso de portainjertos tolerantes o resistentes al patógeno y la aplicación de fungicidas (Belisle et al., 2019; RamírezGil y MoralesOsorio, 2020). Factores como el incremento en la resistencia a fungicidas por parte del fitopatógeno, así como las restricciones establecidas en torno a la aplicación de agroquímicos para la exportación de aguacate, han favorecido la búsqueda de estrategias alternativas de control que sean más amigables con el medio ambiente (CortazarMurillo et al., 2023). En este contexto, el uso de microorganismos como agentes de control biológico de P. cinnamomi ha ganado interés. La mayoría de los reportes disponibles sobre el biocontrol de P. cinnamomi se ha enfocado en evaluar cepas de Trichoderma spp., por ser hongos que presentan diferentes mecanismos de antagonismo (LópezHerrera et al., 1999; Martins et al., 2022). También se ha sugerido el uso de bacterias como Serratia sp. ARP5.1 o Pseudomonas fluorescens como agentes promisorios de biocontrol, por la actividad antagónica de sus metabolitos contra P. cinnamomi (Granada et al., 2018; Sumida et al., 2020). Estos antecedentes demuestran el potencial de bacterias como agentes de biocontrol de P. cinnamomi.
En un estudio previo, MéndezBravo et al. (2018) aislaron la cepa Bacillus sp. A8a a partir de suelo rizosférico de aguacate. Dicha cepa presentó actividad antagónica contra P. cinnamomi en ensayos de antagonismo directo y a través de la emisión de compuestos volátiles; además, los extractos crudos de Bacillus sp. A8a inhibieron totalmente el crecimiento de P. cinnamomi (CortazarMurillo et al., 2023). La capacidad promotora de crecimiento vegetal de Bacillus sp. A8a fue confirmada en la planta modelo Arabidopsis thaliana y en tomatillo (Physalis ixocarpa) (MéndezBravo et al., 2018, 2023). Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad de biocontrol de Bacillus sp. A8a, determinando el efecto de su inoculación sobre variables morfo-fisiológicas y porcentaje de marchitez en plantas de aguacate infectadas por P. cinnamomi.
Materiales y métodosMaterial biológico
Se utilizó como agente potencial de biocontrol la cepa bacteriana Bacillus sp. A8a, la cual se aisló a partir de suelo rizosférico de un árbol de aguacate asintomático en un huerto de Huatusco, Veracruz (MéndezBravo et al., 2018). Como agente patógeno se usó la cepa TGR15 de P. cinnamomi, donada por el Laboratorio de Patología Vegetal del Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales de la Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo y proveniente de raíces de aguacate con pudrición de un huerto en Tinguindín, Michoacán. Se determinó su virulencia en ensayos en hojas de Nicotiana benthamiana (MondragónFlores, 2022).
Preparación de inóculo bacteriano y de la suspensión de zoosporas de P. cinnamomi
Para generar el inóculo bacteriano, la cepa Bacillus sp. A8a fue cultivada en medio Luria Bertani (LB) - agar e incubada durante 24 h a 26 °C. Transcurrido este tiempo, se suspendió una asada de biomasa bacteriana en agua estéril. La concentración del inóculo bacteriano se ajustó a aproximadamente 1.5 × 108 UFC mL1, de acuerdo al punto 0.5 de la escala de McFarland.
La suspensión de zoosporas de P. cinnamomi se preparó de acuerdo a lo descrito por Zentmyer y Chen (1969) con ligeras modificaciones. Brevemente, la cepa P. cinnamomi TGR 15 se cultivó en cajas Petri con agar harina de maíz durante seis días a 25 °C.
Posteriormente, se realizaron cortes cuadriculares de micelio de aproximadamente 0.5 cm2. Los cuadros de micelio se distribuyeron de forma equitativa en dos cajas Petri nuevas, a cada caja se agregaron 10 mL de medio de cultivo líquido V8 clarificado (0.01 g de CaCO3, 10 mL de jugo V8 Campbell’s® y 990 mL de agua destilada) y se incubaron 24 h a 25 °C. Transcurrido este tiempo, se decantó el medio V8, el micelio se lavó con 10 mL de solución de Zentmyer (1.64 g de Ca(NO3)2, 0.05 g KNO3 y 0.48 g de MgSO4 en 1 L de agua tridestilada) y se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con exposición a luz fluorescente. El lavado con solución mineral se repitió seis veces. Posteriormente, el micelio se incubó a 23 °C con exposición a luz fluorescente durante 10 h, seguido de 8 h en oscuridad. Para promover la liberación de zoosporas, se retiró la solución de sales y el micelio se lavó con 10 mL de agua tridestilada a 4 °C. Se agregó nuevamente agua al micelio y se incubó la mezcla durante 20 min a 4 °C. Tras este periodo, se recuperó el agua con las zoosporas de P. cinammomi. Finalmente, las zoosporas se tiñeron con azul de lactofenol (2 gotas en 750 mL de solución) para poder realizar el conteo en una cámara de Nuebauer y se ajustó la concentración de la suspensión a 2.5 × 104 zoosporas mL1.
Implementación del experimento en invernadero
Para evaluar el potencial de Bacillus sp. A8a como agente de biocontrol de P. cinnamo- mi, se utilizaron 90 plantas de aguacate de la variedad Méndez de aproximadamente dos años de edad, las cuales fueron adquiridos en el vivero “Piedras Blancas” (Lagunillas, Michoacán, México). El experimento consistió en cuatro tratamientos: 1) 30 plantas “control”, únicamente tratadas con agua [C]; 2) 30 plantas infectadas por P. cinnamomi [Pc]; 3) 15 plantas inoculadas con Bacillus sp. A8a [B]; y 4) 15 plantas infectadas por P. cinnamomi e inoculadas con Bacillus sp. A8a [BPc] (Reverchon et al., 2023). El día 1, definido como el día de inicio del experimento (t0), la mitad de las plantas (n=45) se infectó con la suspensión de zoosporas de P. cinnamomi, de acuerdo a lo descrito por Aveling (1999) y Masikane et al. (2019). Primero, las plantas se extrajeron de sus bolsas de cultivo y se retiró el exceso de suelo adherido a sus raíces. Posteriormente, su sistema radical se sumergió durante dos horas en una suspensión con una concentración de 4.9 × 102 zoosporas mL1, la cual se preparó diluyendo 1.6 L de la suspensión de zoosporas de partida en 80 L de agua potable. En el caso de la otra mitad de las plantas, sus raíces fueron sumergidas en 80 L de agua potable con 1.6 L de agua tridestilada (plantas sin infectar). Cada planta fue trasplantada a una bolsa de plástico negro de 10 L, con una mezcla de sustrato compuesto de turba (PROMIX®)perlitavermiculita (proporciones 3:1:1, v/v/v) esterilizado a 121 °C durante 1 h, con 1 volumen de suelo del vivero. Después de 48 h, las plantas se sometieron a condiciones de anegamiento (saturación del sustrato) durante cinco días para favorecer el proceso infeccioso de P. cinnamomi. Posteriormente, se drenó el exceso de agua y se continuó con el riego de las plantas con agua potable para mantener la humedad del sustrato. La inoculación de Bacillus sp. A8a se llevó a cabo 15 días antes de la infección de las plantas con P. cinna- momi. Para ello, 30 plantas fueron inoculadas con 250 mL de la suspensión de Bacillus sp.
A8a, aplicada en la base del tallo. Quince de estas plantas fueron asignadas al tratamiento [B], las otras 15 plantas al tratamiento [BPc]. La suspensión bacteriana fue aplicada nuevamente el día posterior a la infección (día 2) y de nuevo 15 días después (día 16). Las plantas de aguacate se distribuyeron de forma aleatoria sobre una cama metálica en el invernadero de la Escuela Nacional de Estudios Superiores de la UNAM - Morelia. El experimento se desarrolló durante los meses de marzo y abril del 2021 a una temperatura promedio de 31
°C registrada a las 11:00 am.
Medición de variables morfológicas y fisiológicas en plantas de aguacate
La medición de variables morfológicas y fisiológicas se realizó a los días 1 (t0), 4 (t1),7 (t2), 13 (t3) y 25 (t4) después de la inoculación (ddi) de P. cinnamomi. En el caso de las variables morfológicas, se registraron mediciones de altura (cm), diámetro (cm), y número de hojas a partir de seis individuos para los tratamientos C y Pc, en cada tiempo; para los tratamientos B y BPc, se realizaron mediciones de tres individuos. Se calculó el porcentaje de marchitez de cada planta con la fórmula siguiente:
de acuerdo a lo reportado en Wang et al. (2006) y Azil et al. (2021).
En el caso de las variables fisiológicas, se llevaron a cabo mediciones de tres plantas por tratamiento. La conductancia estomática (mol CO /m2/s), la tasa fotosintética (µmol/m2/s) y la transpiración (mmol/m2/s) se midieron utilizando el sistema portátil de intercambio de gases LiCor 6400 (LICOR, Lincoln, NE, USA). La medición se realizó en dos hojas extendidas y sin daño aparente por planta seleccionada, entre las 8:00 h y a las 11:00 h, con una intensidad de luz de 1500 µmol/m2/s y CO ambiental. El potencial hídrico (MPa) de la planta se midió en el preamanecer (5:00 h) y al medio día (14:00 h) con una cámara de presión Scholander 1000 (PMS Instrument Co., Albany, OR, EE.UU.), en dos hojas por cada planta, las cuales fueron cubiertas con papel aluminio media hora antes de la medición para permitir la homogenización del potencial hídrico de la hoja con el tallo (AguilarRomero et al., 2017).
Análisis histoquímicos de cortes de tallo y determinación de la presencia de calosa y taninos
Para llevar a cabo la determinación de calosa y de taninos en tallos de aguacate al final del proceso de infección (25 ddi), se cortó un fragmento de tallo de 1.5 cm de longitud en la parte basal de tres plantas por tratamiento, utilizando una tijera de poda. Los fragmentos se procesaron de acuerdo a la metodología descrita en Johansen (1940). Los fragmentos se fijaron durante 24 h en una solución fijadora FAA (alcohol al 70%, formaldehido y agua destilada en proporción 5:5:90). Transcurrido el tiempo de fijación, se retiró la solución FAA y se agregó una solución de etanol-glicerol (1:1, v/v) para preservar las muestras. Posteriormente, las muestras se lavaron con agua corriente, se deshidrataron en concentraciones crecientes de alcohol etílico (30, 50 y 70 %) y se pasaron por una serie de concentraciones crecientes de alcohol terbutílico (Sandoval, 2005). Los fragmentos de tallo se colocaron en parafina histológica (Hycel) y se realizaron cortes de 15-20 µm de grosor de las caras transversal y radial, utilizando un micrótomo rotatorio (Leica RM2125 RTS). Los cortes se tiñeron con una combinación de ácido tánico al 1 % (en agua); cloruro férrico al 3 % (en agua) y lacmoide al 3 % (en solución de etanol 50 % y agua 50 %) de acuerdo con Gurr (1965). Después, los cortes se lavaron con una solución de bicarbonato de sodio al 1 % (en etanol al 50 %), se deshidrataron en concentraciones graduales de alcohol al 70, 80, 90 y 100 % y se aclararon los tejidos con xileno absoluto. Finalmente, los cortes se montaron en resina sintética y se observaron en un microscopio compuesto (Leica DM750M). La cuantificación de taninos se llevó a cabo utilizando imágenes capturadas con el objetivo 20×, en campo claro. Se tomaron imágenes de los cortes transversales de tallos de aguacate de los cuatro tratamientos a los 25 ddi. Las imágenes obtenidas se analizaron con el Software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html).
Análisis estadísticos
El análisis de los resultados se realizó en RStudio, v. 2022.12.0. Se comprobó la normalidad de los datos mediante la prueba de ShapiroWilk y la homocedasticidad de varianza con la prueba de Bartlett. Los datos obtenidos a partir de las mediciones de variables morfológicas y fisiológicas, así como de la cuantificación del contenido de taninos, se analizaron mediante análisis de varianza de dos y de una vía respectivamente, seguidas por una prueba de comparaciones pareadas de Tukey para datos con una distribución normal. Los datos que no presentaron distribución normal se analizaron con un análisis de KruskalWallis y suma de rangos de Wilcoxon con ajuste de BonferroniHolm. Los resultados fueron considerados como significativos con una P ≤ 0.05.
Resultados<bold>Cambios en las variables morfo-fisiológicas de plantas de aguacate en respuesta a la inoculación de <italic>Bacillus</italic> sp. A8a y la infección por <italic>P. cinnamomi</italic>
</bold>
Nuestros resultados muestran que la inoculación de Bacillus sp. A8a en plantas infectadas con P. cinnamomi (tratamiento BPc) disminuyó el porcentaje de marchitez hasta en un 49 % a los 25 ddi, en comparación con plantas infectadas y no inoculadas con la bacteria (tratamiento Pc) (Figura 1). Adicionalmente, se observó que la marchitez en plantas infectadas con P. cinnamomi incrementó a través del tiempo, pasando de 2.9 % (1 ddi) a 50%
Efecto de la inoculación de <italic>Bacillus</italic> sp. A8a y <italic>P. cinnamomi</italic> en árboles de aguacate a los 1, 4, 7, 13 y 25 ddi. A) Porcentaje de marchitez causada por <italic>P. cinnamomi;</italic> B) altura de los árboles (cm); C) diámetro del tallo (cm). Las barras muestran el promedio de los datos (n = 6, tratamientos C y Pc; n = 3, tratamientos B y BPc) ± d.e. Letras diferentes indican diferencias significativas (ANOVA de dos vías, <italic>P ≤</italic> 0.05). En la figura 1A, (+) representa diferencia significativa en relación con () entre tiempos, para el tratamiento Pc (ANOVA, <italic>P ≤</italic> 0.05). D) Fotografías representativas de la parte aérea y del sistema radical de árboles de aguacate a los 25 ddi, en los cuatro tratamientos. C: control; Pc: infectado con <italic>P. cinnamomi</italic>; B: inoculado con <italic>Bacillus</italic> sp. A8a; BPc: infectado con <italic>P. cinnamomi</italic> e inoculado con <italic>Bacillus</italic> sp. A8a.
al final del experimento (25 ddi). En contraste, el porcentaje de marchitez disminuyó en plantas infectadas e inoculadas con Bacillus sp. A8a a lo largo del experimento, pasando de 40.4 % a los 13 ddi a 7.1 % a los 25 ddi (Figura 1A). No obstante, estas diferencias no fueron significativas, probablemente debido a la variación existente dentro de los tratamientos. No se observaron diferencias significativas en la altura de las plantas y diámetro de su tallo entre tratamientos para un mismo tiempo, ni en la interacción del tiempo con el tratamiento (Figuras 1B, C). Tampoco se observaron diferencias significativas en la conductancia estomática, tasa fotosintética y transpiración entre los distintos tratamientos, independientemente de los tiempos de medición (Cuadro 1). Sin embargo, el potencial hídrico a los 25 ddi fue significativamente menor en plantas infectadas con P. cinnamomi (tratamientos Pc y BPc) en comparación con plantas no infectadas (tratamientos C y B), tanto en su medición a las 5:00 h (Figura 2A) como a las 14:00 h (Figura 2B). No se observaron diferencias significativas entre los tratamientos Pc y BPc en cuanto al potencial hídrico (Figura 2).
Tasa fotosintética, conductancia estomática y transpiración en árboles de aguacate infectados con <italic>P. cinnamomi</italic> e inoculados con <italic>Bacillus</italic> sp. A8a
Variables fisiológicas
Tratamientos
Días después de la infección (ddi)
1
4
7
13
25
Tasa fotosintética (µmol/m2/s)
C
0.7 +- 1.1a
2.8 +- 4.4a
4.1 +- 3.6a
1.1 +- 0.6a
4.4 +- 1.9a
Pc
0.7 +- 0.7a
1.8 +- 3.0a
0.9 +- 1.7a
1.5 +- 1.8a
3.7 +- 1.9a
B
0.8 +- 1.1a
1.7 +- 2.7a
3.4 +- 2.8a
2.4 +- 2.0a
0.7 +- 1.0a
BPc
1.0 +- 0.9a
2.1 +- 1.1a
4.3 +- 3.3a
1.8 +- 2.1a
1.8 +- 2.2a
Conductancia estomática (mol CO2 /m2/s)
C
0.5 +- 0.5a
5.2 +- 6.9a
5.0 +- 4.5a
0.9 +- 0.4a
3.7 +- 2.2a
Pc
0.3 +- 0.1a
2.9 +- 3.6a
1.1 +- 1.1a
1.3 +- 1.8a
2.8 +- 1.8a
B
0.2 +- 0.1a
2.3 +- 2.4a
4.5 +- 3.8a
3.5 +- 4.6a
0.7 +- 0.8a
BPc
0.4 +- 0.1a
2.0 +- 0.8a
3.6 +- 2.9a
1.4 +- 1.5a
2.0 +- 2.3a
Transpiración (mmol/m2/s)
C
0.2 +- 0.2a
1.2 +- 1.6a
1.2 +- 1.0a
1.0 +-1.0a
1.1 +- 0.6a
Pc
0.1 +- 0.0a
0.7 +- 0.8a
0.3 +- 0.3a
0.4 +- 0.1a
0.8 +- 0.5a
B
0.0 +- 0.0a
0.6 +- 0.6a
1.4 +- 1.1a
1.6 +- 1.3a
0.2 +- 0.2a
BPc
0.1 +- 0.0a
0.6 +- 0.2a
1.0 +- 0.8a
0.4 +- 0.4a
0.6 +- 0.6a
Los valores reportados muestran el promedio de tres réplicas ± e.e. Los datos de conductancia estomática se encuentran expresados como su valor real multiplicado por 100. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos por cada tiempo (ANOVA, P ≤ 0.05).
Potencial hídrico foliar en árboles de aguacate a los días 1, 4, 7, 13 y 25 ddi. A) Potencial hídrico foliar (MPa) a las 5:00 am; B) potencial hídrico foliar a las 14:00 pm. Las barras muestran el promedio de los datos (n = 3 ± d.e). Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos dentro de un mismo tiempo. El potencial hídrico medido a los 1, 4 y 25 ddi se analizó con un ANOVA de una vía y prueba de Tukey (<italic>P ≤</italic> 0.05). Los datos obtenidos a los 7 y 13 ddi se analizaron con un análisis de varianza de KruskalWallis y suma de rangos de Wilcoxon por ser datos no paramétricos (<italic>P ≤</italic> 0.05).
<bold>Acumulación de taninos en tallos de aguacate en respuesta a la infección por <italic>P. cinna- momi</italic> y a la inoculación de <italic>Bacillus</italic> sp. A8a</bold>
Se cuantificó el porcentaje del área ocupada por taninos a los 25 ddi. La infección por P. cinnamomi triplicó el área de taninos en el xilema interno y externo, comparado con las plantas del control (Cuadro 2). En contraste, la inoculación de Bacillus sp. A8a indujo una mayor acumulación de taninos en el córtex, aunque ésta no fue estadísticamente significativa. La inoculación de Bacillus sp. A8a multiplicó por dos la acumulación de taninos en el córtex de las plantas no infectadas por el patógeno (37.5 % en el tratamiento B), e indujo un incremento del 16.9 % en el área de taninos en el córtex de las plantas infectadas (tratamiento BPc), comparado con plantas infectadas pero no inoculadas con la bacteria. Adicionalmente, en plantas infectadas, la inoculación de la cepa A8a redujo la acumulación de taninos en el xilema externo e interno (Cuadro 2; Figura 3), evidenciando un cambio en el patrón de acumulación de taninos inducido por la cepa de biocontrol. En cuanto a la determinación de calosa, no se encontró en ninguno de los tejidos analizados.
Porcentaje del área de taninos ocupada a los 25 ddi en las diferentes secciones de tallo de árboles de aguacate infectados por <italic>P. cinnamomi</italic> e inoculados con <italic>Bacillus</italic> sp. A8a.
Tratamientos
Porcentajes del área de taninos (%)
Córtex
Xilema externo
Xilema interno
C
17.9 +- 16.0a
16.5 +- 0.9a
16.0 +- 4.2a
Pc
24.5 +- 10.6a
55.0 +- 26.2a
50.3 +- 25.1a
B
37.5 +- 9.0a
26.1 +- 16.1a
17.1 +- 3.8a
BPc
41.4 +- 1.4a
15.1 +- 1.1a
27.4 +- 0.7a
Los valores reportados muestran el promedio de dos mediciones ± e.e. Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos para una misma área del tallo (KruskalWallis, P ≤ 0.05).
Discusión
A través de un experimento curso temporal en invernadero, encontramos que la inoculación de Bacillus sp. A8a en plantas de aguacate infectadas con P. cinnamomi redujo hasta en un 49 % la marchitez por Phytophthora, 25 días después de la infección, en comparación con plantas infectadas pero no inoculadas con la bacteria. En trabajos previos, reportamos el potencial de Bacillus sp. A8a para inhibir a P. cinnamomi en pruebas in vitro y su capacidad para producir compuestos antimicrobianos volátiles del grupo de las pirazinas y cetonas, así como compuestos difusibles como macrolactina, dificidina, bacileno y bacilisina (Méndez- Bravo et al., 2018; CortazarMurillo et al., 2023). El presente estudio permitió corroborar la
Acumulación de taninos en secciones transversales del córtex (C), xilema externo y xilema interno de tallos de aguacate de los cuatro tratamientos a los 25 ddi. <bold>Figuras A - C</bold>: Tratamiento Control. <bold>A</bold>. Se observan pocas células taníferas (T) dispersas en el tejido. <bold>B</bold>. Las células taníferas (T) se observan en el parénquima radial. Se indican los vasos (V) y el parénquima radial (r). <bold>C</bold>. Se observan pocas células taníferas (T) en el parénquima axial y radial (r). Ph = floema secundario. Escala: A-C. 30 μm. <bold>Figuras D - F</bold>: Tratamiento Pc. <bold>D</bold>. Se observan abundantes células taníferas (T). <bold>E.</bold> Las células taníferas (T) se observan tanto en el parénquima radial como axial. V = vasos. <bold>F</bold>. Las células taníferas (T) se concentran en las células radiales. Escala: D. 60 μm. E y F. 30 μm. <bold>Figuras G - I:</bold> Tratamiento B. <bold>G.</bold> Sección transversal a través del floema (Ph) y del córtex (C). Se observan algunas células taníferas (T) en medio de células del parénquima llenas de almidón (asteriscos). <bold>H</bold>. Una larga cadena de vasos (V) se observa en el centro de la imagen. Sólo se observan algunas células taníferas (T) en el parénquima radial. <bold>I.</bold> Las células taníferas (T) son aún menos frecuentes que en el xilema externo. Escala: G. 25 μm. H y I. 30 μm. <bold>Figuras J - L:</bold> Tratamiento BPc. <bold>J.</bold> Se observan células taníferas (T). <bold>K</bold>. Se observan vasos (V) agrupados o aislados y algunas células taníferas (T) en el parénquima radial. <bold>L</bold>. Algunas células taníferas (T) se observan de manera aislada en el parénquima axial. Los vasos (V) se agrupan en cadenas radiales o en grupos de cuatro. Escala: J L. 35 μm.
capacidad de la cepa A8a para el control de la marchitez por Phytophthora en su hospedante natural, P. americana. Nuestros resultados enfatizan el potencial de las rizobacterias para inhibir el crecimiento de P. cinnamomi y los daños ocasionados por la marchitez por Phyto- phthora, confirmando lo previamente descrito por Ramírez-Gil y Morales-Osorio (2020) con la cepa Bacillus sp. BC3 o por RamírezRestrepo et al. (2021) con Serratia plymuthica AED38. Aunque la reducción en la incidencia de síntomas de marchitez en el tratamiento BPc no fue estadísticamente significativa, la elevada variación intra-tratamiento, independientemente de la actividad de biocontrol de Bacillus sp. A8a, podría haber repercutido en la ausencia de diferencias significativas. Esta alta variación podría estar asociada a la plasticidad fenotípica que suele observarse en aguacate y en sus portainjertos (Ashworth y Clegg, 2003), y podría controlarse aumentando el número de réplicas o la duración del experimento. Un monitoreo más largo de los efectos de la cepa A8a en las plantas inoculadas es por lo tanto necesario, ya que, al ser plantas leñosas, las respuestas del aguacate a tratamientos biológicos enfocados a mejorar su crecimiento y productividad pueden tardar en observarse (Barra et al., 2016). En este experimento, no fue posible extender la duración del experimento debido a la muerte de las plantas del tratamiento Pc después de los 25 ddi. Phytophthora cinnamomi ataca las raíces secundarias de los árboles de aguacate, responsables de la absorción de nutrimentos y agua, provocando marchitez, defoliación, reducción en la productividad y, consecuentemente, la muerte del árbol (Hardham, 2005; MéndezBravo et al., 2018). Estos síntomas pueden estar asociados en parte al desarrollo de un estrés hídrico severo en la planta infectada. En nuestro estudio, la infección por P. cinnamomi generó mayor estrés hídrico en las plantas infectadas (Pc y BPc) que en las no infectadas (C y B) a los 25 ddi, lo que concuerda con los resultados obtenidos por Sterne et al. (1978). De forma interesante, la marchitez en plantas infectadas (Pc) fue hasta un 49 % superior a los síntomas en plantas infectadas pero inoculadas con Bacillus sp. A8a (BPc), lo que sugiere que la cepa A8a reduce el daño ocasionado por P. cinnamomi sin compensar el estrés hídrico. Adicionalmente, no se detectaron diferencias significativas en la conductancia estomática y transpiración, ni en la tasa fotosintética, entre plantas sanas y plantas infectadas. Ploetz y Schafeer (1989) sugieren que el efecto de P. cinnamomi en la asimilación de CO2, la transpiración y la conductancia estomática en árboles de aguacate no es consistente, a menos de que se agregue otro factor de estrés como condiciones de anegamiento, lo cual induce consistentemente estrés hídrico en árboles infectados. Los valores más bajos de las variables fisiológicas observados a los 7 ddi en el tratamiento Pc (Cuadro 1), aunque no significativamente, podrían confirmar esta hipótesis, ya que se mantuvieron condiciones de anegamiento durante cinco días en nuestro experimento.
La infección por P. cinnamomi y la inoculación con Bacillus sp. A8a indujeron modificaciones en la acumulación de taninos presentes en las diferentes secciones del tallo de aguacate a los 25 ddi. En el tratamiento Pc, se observó la acumulación de taninos en los xilemas externo e interno. Los compuestos fenólicos, entre ellos los taninos, desempeñan una función importante en los mecanismos de defensa vegetal ante el estrés biótico (Gallardo et al., 2019), a través de mecanismos que involucran la inhibición de enzimas fúngicas extracelulares, reducción de la disponibilidad de nutrientes e inhibición de la fosforilación oxidativa (Rashad et al., 2020). La acumulación de taninos en el xilema, en respuesta a la infección por P. cinnamomi, probablemente forma parte de la respuesta de defensa de la planta y contribuye a su resistencia ante la marchitez por Phytophthora (Phillips et al., 1987). Por otro lado, las plantas inoculadas con la cepa A8a (tratamientos B y BPc) presentaron una mayor acumulación de taninos en el córtex que las plantas no inoculadas (tratamientos C y Pc, respectivamente). La acumulación de compuestos fenólicos en tejidos vegetales como efecto positivo de la inoculación de agentes de biocontrol también ha sido demostrada en otros patosistemas. Por ejemplo, Javed et al. (2021) describieron que la inoculación con Bacillus megaterium y Pseudomonas fluorescens incrementó la deposición de compuestos fenólicos en secciones vasculares de tallos y raíces de frijol mungo (Vigna radiata) infectados por Macrophomina phaseolina, lo que impidió la colonización del micelio en el lumen de los vasos xilemáticos, a diferencia de las plantas no tratadas con estas bacterias. La observación de una mayor densidad de taninos en los cortes histológicos de córtex provenientes de los tratamientos inoculados con Bacillus sp. A8a sugiere una acción del agente de biocontrol sobre una de las primeras barreras físicas de defensa vegetal y su posible contribución en la tolerancia de las plantas de aguacate ante la marchitez por Phyto- phthora. Sin embargo, investigaciones futuras deberán enfocarse en elucidar los mecanismos que rigen la capacidad de biocontrol de la cepa A8a.
Conclusiones
En este trabajo se confirma la actividad de biocontrol de Bacillus sp. A8a ante la marchitez por Phytophthora, actividad previamente reportada in vitro, y sugiere que dicha actividad puede deberse en parte a la acumulación diferencial de taninos en el córtex de las plantas inoculadas con la bacteria. Futuros estudios podrían corroborar el potencial de biocontrol de Bacillus sp. A8a en condiciones de campo. Finalmente, para garantizar su máxima eficiencia en campo, es importante verificar la colonización exitosa de la cepa A8a en la rizósfera de P. americana y mejorar nuestro entendimiento de sus interacciones con la microbiota rizosférica nativa del aguacate, para poder contribuir a un manejo integral más sustentable de la marchitez por Phytophthora.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el proyecto FOSEC-SEP-CONAHCYT no. A1-S-30794. También agradecemos el apoyo de CONAHCYT mediante una beca postdoctoral otorgada al primer autor (Programa “Estancias Posdoctorales por México” no. 417707). Agradecemos a Silvana Martén Rodríguez por el uso del invernadero; a Alejandro Méndez Bravo y a Yareli PérezBautista por su apoyo durante el muestreo; a Marlene Díaz Celaya por su apoyo técnico en el proceso de liberación de zoosporas de P. cinnamomi y a Gerardo Rodríguez Alvarado por su contribución en el aislamiento de la cepa de P. cinnamomi.
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The objective was to assess the biocontrol capacity of Bacillus sp. A8a in avocado (Persea americana) plants infected by Phytophthora cinnamomi.
Materials and Methods.
A greenhouse experiment was implemented with four treatments: 1) control plants; 2) plants infected with P. cinnamomi; 3) plants inoculated with Bacillus sp. A8a; 4) plants infected with P. cinnamomi and inoculated with Bacillus sp. A8a. We evaluated several morphophysiological variables during the experiment, which lasted 25 days after infection (dai). Moreover, we analyzed tannin density in stems at 25 dai to determine the plant defense response against the disease.
Results.
Inoculation with strain A8a reduced wilting symptoms by 49 % at 25 dai, compared with non-inoculated plants. No differences were detected in morpho- physiological variables between treatments. However, a greater tannin accumulation was registered in the xylem of infected plants, whilst plants inoculated with strain A8a displayed a larger tannin density in the cortex.
Conclusion.
Our results confirm the biocontrol activity of Bacillus sp. A8a in avocado plants and suggest that tannin differential accumulation in the cortex of plants inoculated with the bacteria may contribute to the enhanced tolerance of avocado plants against Phytophthora root rot.
Mexico is the main producer and exporter of avocado (Persea americana) in the world, with an annual production of nearly 2.4 million tons (FAOSTAT, 2020). Nationwide, Michoacán is the state with the highest production (SIAP, 2019). However, the incidence of pests and diseases has restricted the productivity of the crop (TapiaRodríguez et al., 2020). One of the most destructive diseases of avocado orchards worldwide is the wilting or root rot caused by the oomycete Phytophthora cinnamomi (Van den Berg et al., 2021). In Mexico, P. cinnamomi is found in the main avocadoproducing areas, with an estimated incidence of 5 to 90%, thus considered one of the main limiting factors of the production of this fruit (AgapitoAmador et al., 2022; MondragónFlores et al., 2022).
Phytophthora cinnamomi affects all avocado varieties and has a higher incidence in soils with poor drainage, due to its infection mechanism, which takes place through motile zoospores (Hardham, 2005) or chlamydospores (Hwang and Ko, 1978). P. cinnamomi causes necrosis in fine roots, thus limiting the uptake of water and nutrients, subsequently induces leaf wilting, and finally, leaf wilting, and finally, tree dieback (Hardham, 2005). Among the structural and/or biochemical defense responses of the host to the infection by P. cinnamomi, the accumulation of lignin or callose has been reported as a reinforcement of the cell wall, combined with the accumulation of phenolic compounds in roots and the production of reactive oxygen species (ROS) (van der Berg et al., 2018; Camisón et al., 2019). In other hosts, the defense responses against P. cinnamomi include the accumulation of tannins (Camisón et al., 2019). However, further research on the defense mechanisms in P. americana varieties against the infection by P. cinnamomi are necessary to broaden our understanding of this pathosystem (van der Berg et al., 2021).
The management strategies of Phytophthora root rot usually include cultural practices aimed at reducing water saturation in soils, the use of pathogentolerant or resistant rootstocks and the use of fungicides (Belisle et al., 2019; Ramírez Gil and MoralesOsorio, 2020). Factors such as the increase in the resistance of the phytopathogen to fungicides, as well as the restrictions surrounding the use of agrochemicals for the export of avocado, have favored the search for alternative, more ecofriendly control strategies (CortazarMurillo et al., 2023). In this context, the use of microorganisms as biological control agents of P. cinnamomi has gained increasing interest. Most of the available reports on the biocontrol of P. cinnamomi have focused on evaluating strains of Trichoderma spp., since these are fungi that display different antagonism mechanisms (López-Herrera et al., 1999; Martins et al., 2022). Bacteria such as Serratia sp. ARP5.1 or Pseudomonas fluorescens, have also been suggested as promising biocontrol agents, due to the antagonistic activity of their metabolites against P. cinnamomi (Granada et al., 2018; Sumida et al., 2020). These previous reports show the potential of bacteria as biocontrol agents of P. cinnamomi.
In an earlier study, MéndezBravo et al. (2018) isolated the strain Bacillus sp. A8a from the rhizospheric soil of avocado. This strain displayed antagonistic activity against P. cinnamomi in direct antagonism tests and through the emission of volatile compounds. In addition, the crude extracts of Bacillus sp. A8a completely inhibited the growth of P. cinnamomi (CortazarMurillo et al., 2023). The plant growth promoting ability of Bacillus sp. A8a was confirmed in the model plant Arabidopsis thaliana and in tomatillo (Physalis ixocarpa) (MéndezBravo et al., 2018, 2023). Therefore, the aim of this study was to assess the biocontrol ability of Bacillus sp. A8a, through the evaluation of the effect of its inoculation on morpho- physiological variables and percentage of wilt on avocado plants infected by P. cinnamomi.
Materials and MethodsBiological material
Bacterial strain Bacillus sp. A8a, which was isolated from the rhizospheric soil of an avocado tree with Phytophthora wilt symptoms in an orchard in Huatusco, Veracruz (MéndezBravo et al., 2018), was used as a potential biocontrol agent. The pathogenic agent used in this study was the strain TGR15 of P. cinnamomi, donated by the Plant Pathology Laboratory of the Instituto de Investigaciones Agropecuarias y Forestales of the Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo- and isolated from rotting avocado roots in an orchard in Tinguindín, Michoacán. Its virulence was determined in tests performed on Nicotiana benthamiana leaves (MondragónFlores, 2022).
<bold>Preparation of bacterial inoculant and of the <italic>P. cinnamomi</italic> zoospore suspension</bold>
To produce the bacterial inoculant, the strain Bacillus sp. A8a was streaked on Luria Bertani (LB) agar medium and incubated for 24 h at 26 °C. After this time, a loopful of bacterial biomass was suspended in sterile water. The concentration of the inoculant was adjusted to approximately 1.5 × 108 CFU mL1, according to the 0.5 standard of the McFarland scale.
The P. cinnamomi zoospore suspension was prepared as described by Zentmyer and Chen (1969) with slight modifications. Briefly, the P. cinnamomi TGR 15 strain was cultivated in Petri dishes with cornmeal agar for six days at 25 °C. Later, mycelial squares of approximately 0.5 cm2 were cut, evenly distributed into two new Petri dishes and 10 mL of clarified V8 liquid culture medium (0.01 g of CaCO3, 10 mL of Campbell’s® V8 juice and 990 mL of distilled water) and incubated for 24 h at 25 °C. After this time, the V8 medium was discarded, the mycelium was washed with 10 mL of Zentmyer solution (1.64 g of Ca(NO3)2, 0.05 g KNO3 and 0.48 g of MgSO4 in 1 L of distilled water) and incubated for 30 min at room temperature under fluorescent light. The wash procedure with mineral solution was repeated six times. The mycelium was then incubated at 23 °C with exposure to fluorescent light for 10 h, followed by 8 h in the dark. To promote the release of zoospores, the salt solution was removed and the mycelium was washed with 10 mL of distilled water at 4 °C. Subsequently, water was added again and the mycelium - water mixture was incubated for 20 min at 4 °C. After this time, the water with P. cinammomi zoospores was recovered. Finally, the zoospores were stained with lactophenol blue (2 drops in 750 mL of solution) to be able to count them in a Nuebauer chamber and the concentration of the suspension was adjusted to 2.5 × 104 zoospores mL1.
Implementation of the greenhouse experiment
To evaluate the potential of Bacillus sp. A8a as a biocontrol agent against P. cinnamomi, 90 avocado plants of the Méndez variety, of approximately two years old, were acquired from the “Piedras Blancas” nursery (Lagunillas, Michoacán, Mexico). The experiment consisted of four treatments: 1) 30 “control” plants, treated only with water [C]; 2) 30 plants infected with P. cinnamomi [Pc]; 3) 15 plants inoculated with Bacillus sp. A8a [B]; and 4) 15 plants infected with P. cinnamomi and inoculated with Bacillus sp. A8a [BPc] (Reverchon et al., 2023). On day 1, defined as the first day of the experiment (t0), half of the plants (n=45) were infected with the P. cinnamomi zoospore suspension, as described by Aveling (1999) and Masikane et al. (2019). First, the plants were retrieved from their grow bags and the excess soil was removed from their roots. Later, their root system was submerged for two hours in a suspension with a concentration of 4.9 × 102 zoospores mL1, which was prepared by diluting 1.6 L of the starting zoospore suspension in 80 L of drinking water. The roots from the other half of the plants were submerged in 80 L of drinking water with 1.6 L of distilled water (noninfected plants). Each plant was transplanted into a 10 L black plastic bag, with a substrate mixture of peat (PROMIX®)perlitevermiculite (ratio 3:1:1, v/v/v) sterilized at 121 °C for 1 h, with 1 volume of plant nursery soil. After 48 h, the plants were placed under waterlogging conditions (substrate saturation) for five days to favor the infectious process of P. cinnamomi. Next, the excess water was drained and plants were watered with drinking water throughout the experiment to maintain the humidity of the substrate. Bacillus sp. A8a was inoculated 15 days before the infection of the plants with P. cinnamomi. For this, 30 plants were inoculated with 250 mL of the Bacillus sp. A8a suspension, applied on the base of the stem. Fifteen of these plants were assigned to treatment [B], and the other 15 plants, to treatment [BPc]. The bacterial suspension was applied again on the day after the infection (day 2) and once again 15 days later (day 16). The avocado plants were distributed randomly over a metal bed in the greenhouse of the Escuela Nacional de Estudios Superiores (National School for Higher Studies) of the UNAM - Morelia. The experiment was carried out in March and April, 2021, at an average temperature of 31 °C recorded at 11:00 am.
Measurement of morphological and physiological variables in avocado plants
The measurement of morphological and physiological variables was carried out at days 1 (t0), 4 (t1),7 (t2), 13 (t3) and 25 (t4) after inoculation (dai) with P. cinnamomi. The morphological variables that were recorded were height (cm), diameter (cm), and number of leaves, each measured from six individuals for treatments C and Pc, at each time; for treatments B and BPc, measurements were taken from three individuals. The percentage of wilting of each plant was calculated using the following formula:
as reported by Wang et al. (2006) and Azil et al. (2021).
For physiological variables, three plants were measured per treatment. Stomatal conductance (mol CO2/m2/s), photosynthetic rate (µmol/m2/s) and transpiration (mmol/m2/s) were measured using the portable gas exchange system LiCor 6400 (LICOR, Lincoln, NE, USA). The measurements were performed on two extended leaves with no apparent damage per selected plant, between 8:00 h and 11:00 h, with a light intensity of 1500 µmol/m2/s and environmental CO2. The water potential (MPa) of the plant was measured at predawn (5:00 h) and at midday (14:00 h) with a Scholander 1000 pressure chamber (PMS Instrument Co., Albany, OR, EE.UU.), in two leaves per plant, which were covered with aluminum foil half an hour before measuring to allow the water potential of the leaf and of the stem to become homogenized (AguilarRomero et al., 2017).
Histochemical analyses of stem sections and determination of the presence of callose and tannins
To determine callose and tannins in the avocado stems at the end of the infection process (25 dai), a 1.5 cmlong fragment of stem was cut from the basal part of three plants per treatment using pruning shears. The fragments were processed following the methodology described in Johansen (1940). The fragments were fixed for 24 h in an FAA solution (70 % alcohol, formaldehyde and distilled water in a 5:5:90) ratio. After the fixation period, the FAA solution was removed and an ethanol-glycerol solution was added (1:1, v/v) to preserve the samples. Later, the samples were washed with tap water, dehydrated in increasing concentrations of ethyl alcohol (30, 50 and 70 %) and were passed through a series of increasing concentrations of tertbutyl alcohol (Sandoval, 2005). The stem fragments were placed in histological paraffin (Hycel) and 15-20 µm-thick cuts were made on the transverse and radial faces, using a rotary microtome (Leica RM2125 RTS). The sections were stained with a combination of 1 % tannic acid (in water); 3 % ferric chloride (in water) and 3 % lacmoid (in a 50 % ethanol and 50 % water solution), according to Gurr (1965). The sections were then washed with a 1% sodium bicarbonate solution (in 50 % ethanol), dehydrated in gradual concentrations of alcohol at 70, 80, 90 and 100 % and the tissues were clarified with absolute xylene. Finally, the sections were mounted on synthetic resin and observed under a compound microscope (Leica DM750M). The tannins were quantified using images captured with a 20× lens in bright-field microscopy. Images were taken of the transversal sections of avocado stems of the four treatments at 25 dai. The obtained images were analyzed using the Software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html).
Statistical analyses
The results were analyzed in RStudio, v. 2022.12.0. Data normality was verified using the ShapiroWilk test and the variance homogeneity, with the Bartlett test. The data obtained from the measurements of morphological and physiological variables, as well as from the quantification of the content of tannins, were analyzed using twoway and oneway analyses of variance, respectively, followed by Tukey’s test for normally distributed data. The data that did not exhibit a normal distribution were analyzed using a KruskalWallis test and a Wilcoxon ranksum test with a Bonferroni-Holm adjustment. Results were considered significant with a P ≤ 0.05.
Results<bold>Changes in the morpho-physiological variables of avocado plants in response to the inoculation of <italic>Bacillus</italic> sp. A8a and infection by <italic>P. cinnamomi</italic>
</bold>
Our results show that the inoculation of Bacillus sp. A8a in plants infected with P. cinnamomi (treatment BPc) reduced the percentage of wilting by up to 49 % at 25 dai, in comparison to infected plants that were not inoculated with the bacteria (treatment Pc) (Figure 1). In addition, wilting in plants infected with P. cinnamomi increased with time, going from 2.9 % (1 dai) to 50 % at the end of the experiment (25 dai). In contrast, the percentage of wilting decreased in infected plants inoculated with Bacillus sp. A8a throughout the experiment, going from 40.4
% at 13 dai to 7.1 % at 25 dai (Figure 1A). Nevertheless, these differences were not significant, most likely due to the intra-treatment variation.
No significant differences were observed in plant height and stem diameter between treatments for a given time, nor in the interaction between time and treatment (Figures 1B, C). Moreover, no significant differences were detected in the stomatal conductance, photosynthetic rate and transpiration between treatments, regardless of the time of measurement (Table 1). However, the water potential at 25 dai was significantly lower in plants infected with P. cinnamomi (treatments Pc and BPc) than in noninfected plants (treatments C and B), both in their measurement at 5:00 h (Figure 2A) and at 14:00 h (Figure 2B). No significant differences were observed between treatments Pc and BPc in terms of water potential (Figure 2).
Accumulation of tannins in avocado stems in response to the infection by P. cinnamomi and to the inoculation of Bacillus sp. A8a
The percentage of the area covered by tannins at 25 dai was quantified. The infection caused by P. cinnamomi tripled the area of tannins in the inner and outer xylem, compared to the control plants (Table 2). In contrast, the inoculation of Bacillus sp. A8a induced a greater accumulation of tannins in the cortex, although not significantly. The inoculation of Bacillus sp. A8a doubled the accumulation of tannins in the cortex of the uninfected plants (37.5 % in treatment B), and induced an increase of 16.9 % in the area of tannins in the cortex of infected plants (treatment BPc), in comparison with infected plants that were not inoculated with the bacteria. In addition, in infected plants, the inoculation of strain A8a reduced the accumulation of tannins in the inner and outer xylem (Table 2; Figure 3), displaying a shift in the accumulation pattern of tannins induced by the biocontrol strain. Finally, callose was not found in any of the analyzed tissues.
Effect of the inoculation of <italic>Bacillus</italic> sp. A8a and <italic>P. cinnamomi</italic> in avocado trees at 1, 4, 7, 13 and 25 dai (days after infection). A) Percentage of wilting caused by <italic>P. cinnamomi</italic>; B) tree height (cm); C) stem diameter (cm). Bars show the average of the data (n = 6, treatments C and Pc; n = 3, treatments B and BPc) ± s.d. Different letters indicate significant differences (two-way ANOVA, <italic>P</italic> ≤ 0.05). In <xref ref-type="fig" rid="f4">Figure 1</xref>A, (+) indicates significant differences between times, compared with (-), for the Pc treatment (ANOVA, <italic>P</italic> ≤ 0.05). D) Representative photographs of the aerial parts and root systems of avocado trees at 25 dai, in the four treatments. C: control; Pc: infected with <italic>P. cinnamomi</italic>; B: inoculated with <italic>Bacillus</italic> sp. A8a; BPc: infected with <italic>P. cinnamomi</italic> and inoculated with <italic>Bacillus</italic> sp. A8a.
Photosynthetic rate, stomatal conductance and transpiration in avocado trees infected with <italic>P. cinnamomi</italic> and inoculated with <italic>Bacillus</italic> sp. A8a.
Physiological variables
Treatments
Days after infection (dai)
1
4
7
13
25
Photosynthetic rate (µmol/m2/s)
C
0.7 +- 1.1a
2.8 +- 4.4a
4.1 +- 3.6a
1.1 +- 0.6a
4.4 +- 1.9a
Pc
0.7 +- 0.7a
1.8 +- 3.0a
0.9 +- 1.7a
1.5 +- 1.8a
3.7 +- 1.9a
B
0.8 +- 1.1a
1.7 +- 2.7a
3.4 +- 2.8a
2.4 +- 2.0a
0.7 +- 1.0a
BPc
1.0 +- 0.9a
2.1 +- 1.1a
4.3 +- 3.3a
1.8 +- 2.1a
1.8 +- 2.2a
Stomatal conductance (mol CO2 /m2/s)
C
0.5 +- 0.5a
5.2 +- 6.9a
5.0 +- 4.5a
0.9 +- 0.4a
3.7 +- 2.2a
Pc
0.3 +- 0.1a
2.9 +- 3.6a
1.1 +- 1.1a
1.3 +- 1.8a
2.8 +- 1.8a
B
0.2 +- 0.1a
2.3 +- 2.4a
4.5 +- 3.8a
3.5 +- 4.6a
0.7 +- 0.8a
BPc
0.4 +- 0.1a
2.0 +- 0.8a
3.6 +- 2.9a
1.4 +- 1.5a
2.0 +- 2.3a
Transpiration (mmol/m2/s)
C
0.2 +- 0.2a
1.2 +- 1.6a
1.2 +- 1.0a
1.0 +-1.0a
1.1 +- 0.6a
Pc
0.1 +- 0.0a
0.7 +- 0.8a
0.3 +- 0.3a
0.4 +- 0.1a
0.8 +- 0.5a
B
0.0 +- 0.0a
0.6 +- 0.6a
1.4 +- 1.1a
1.6 +- 1.3a
0.2 +- 0.2a
BPc
0.1 +- 0.0a
0.6 +- 0.2a
1.0 +- 0.8a
0.4 +- 0.4a
0.6 +- 0.6a
Values show the average of three replicates ± e.e. Stomatal conductance data are expressed as their original value multiplied by 100. Different letters indicate significant differences between treatments within each time (ANOVA, P ≤ 0.05).
Discussion
Using a greenhouse timecourse experiment, we found that the inoculation of Bacillus sp. A8a in avocado plants that were infected with P. cinnamomi reduced wilting symptoms by up to 49 %, 25 days after infection, in comparison with infected plants that were not inoculated with the bacteria. In previous studies, we reported the potential of Bacillus sp. A8a to inhibit P. cinnamomi in in vitro tests and its ability to produce volatile antimicrobial compounds from the group of pyrazines and ketones, as well as diffusible compounds such as macrolactin, difficidin, bacillaene and bacilysin (Méndez-Bravo et al., 2018; CortazarMurillo et al., 2023). This study helped verify the ability of strain A8a to control wilting by Phytophthora in its natural host, P. americana. Our results emphasize the potential
Leaf water potential in avocado trees at 1, 4, 7, 13 and 25 dai. A) Leaf water potential (MPa) at 5:00 am; B) foliar water potential at 14:00 pm. Bars show the average of the data (n = 3 ± s.d.). Different letters indicate significant differences between treatments at the same time. The water potential measured at 1, 4 and 25 dai was analyzed with a oneway ANOVA and Tukey’s test (<italic>P</italic> ≤ 0.05). Non-parametric data recorded at 7 y 13 dai were analyzed with KruskalWallis and Wilcoxon rank sum tests (<italic>P</italic> ≤ 0.05).
Percentage of the area occupied by tanniniferous cells at 25 dai in differ ent stem sections of avocado trees infected by <italic>P. cinnamomi</italic> and inocu lated with <italic>Bacillus</italic> sp. A8a.
Treatments
Area occupied by tannins (%)
Cortex
Outer xylem
Inner xylem
C
17.9 +- 16.0a
16.5 +- 0.9a
16.0 +- 4.2a
Pc
24.5 +- 10.6a
55.0 +- 26.2a
50.3 +- 25.1a
B
37.5 +- 9.0a
26.1 +- 16.1a
17.1 +- 3.8a
BPc
41.4 +- 1.4a
15.1 +- 1.1a
27.4 +- 0.7a
Values represent the average of two measurements ± e.e. Different letters indicate significant differences between treatments for the same stem area (Kruskal-Wallis, P ≤ 0.05).
of rhizobacteria to inhibit the growth of P. cinnamomi and reduce the damage caused by wilting by Phytophthora, confirming previous reports by Ramírez-Gil and MoralesOsorio (2020) with strain Bacillus sp. BC3 or by RamírezRestrepo et al. (2021) with Serratia plymuthica AED38. Although the reduction of the incidence of wilting symptoms in treatment BPc was not statistically significant, the high intratreatment variation, regardless of the biocontrol activity of Bacillus sp. A8a, may have led to the lack of significant differences. This high variation may be related to the phenotypical plasticity that is usually found in avocado and in its rootstocks (Ashworth and Clegg, 2003), and may be controlled by increasing either the number of replicates or the duration of the experiment. A longer monitoring of the effects of strain A8a on inoculated plants is therefore necessary, since, as a woody plant, the responses of avocado to biological treatments aimed at improving its growth and productivity may take time to appear (Barra et al., 2016). In this case, it was not possible to extend the duration of the experiment due to the death of the plants in treatment Pc at 25 dai. Phytophthora cinnamomi attacks the feeder roots of the avocado trees, which are responsible for the absorption of nutrients and water, causing wilting, defoliation, loss of productivity and, ultimately, the death of the tree (Hardham, 2005; MéndezBravo et al., 2018). These symptoms may be partly related to the development of a severe water stress in the infected plant. In this study, the infection by P. cinnamomi produced greater water stress in infected plants (Pc y BPc) than in uninfected plants (C and B) at 25 dai, in agreement with results obtained by Sterne et al. (1978). Interestingly, wilting in infected plants (Pc) was up to 49 % higher than that of infected plants which were inoculated with Bacillus sp. A8a (BPc), suggesting that strain A8a reduces the damage caused by P. cinnamomi without compensating the water stress. In addition, no significant differences were
Tannin accumulation in crosssections of the cortex (C), outer xylem and inner xylem of avocado stems from the four treatments at 25 dai. A - C: Control treatment. A. A few tanniniferous cells (T) are observed interspersed in the tissue. B. Tanniniferous cells (T) are observed in the ray parenchyma. Vessels (V) and rays (r) are indicated. C. A few tanniniferous cells (T) are observed in the axial parenchyma and in some radial parenchyma (r). Ph = secondary phloem. Scale: A - C. 30 μm. Figures D - F: treatment Pc. D. Abundant tanniniferous cells (T) are observed. E. Tanniniferous cells (T) are in the radial as well as in the axial parenchyma. V = vessels. F. Tanniniferous cells (T) are mostly concentrated in the radial cells. Scale: D. 60 μm. E and F. 30 μm. Figures G - I: treatment B. G. Cross-section through the secondary phloem (Ph) and cortex (C). Some tanniniferous cells are interspersed amid parenchyma cells full with starch (asterisks). H. A long radial chain of vessels (V) can be observed in the center of the image. Only a few tanniniferous cells (T) are observed in the radial parenchyma. I. Tanniniferous cells (T) are even scarcer than in the outer xylem. Scale: G. 25 μm. H and I. 30 μm. Figures J - L: treatment BPc. J. Tanniniferous cells (T) are observed. K. Grouped or solitary vessels (V) and some tanniniferous cells (T) are observed in the radial parenchyma. L. Few tanniniferous cells (T) are observed in the axial parenchyma. Vessels (V) are grouped in radial chains or in groups of four. Scale: J - L. 35 μm.
found in the stomatal conductance and transpiration, nor in the photosynthetic rate, between healthy and infected plants. Ploetz and Schafeer (1989) suggest that the effect of P. cinnamomi on CO2 assimilation, transpiration and stomatal conductance in avocado trees is not consistent, unless another stress factor is added, such as waterlogged conditions, which consistently induces water stress in infected trees. The lowest values of the physiological variables were observed 7 dai in the Pc treatment (Table 1), although not significant, may confirm this hypothesis, since waterlogged conditions were maintained for five days in our experiment.
The infection by P. cinnamomi and the inoculation with Bacillus sp. A8a induced modifications in the accumulation of tannins in the different sections of the avocado stem at 25 dai. In the Pc treatment, the accumulation of tannins was observed in the outer and inner xylem. Phenolic compounds, such as tannins, play an important part in the plant defense mechanisms against biotic stress (Gallardo et al., 2019), and are involved in the inhibition of extracellular fungal enzymes, the reduction in nutrient availability and the inhibition of oxidative phosphorylation (Rashad et al., 2020). The accumulation of tannins in the xylem in response to the infection by P. cinnamomi is probably part of the plant’s defense and contributes to its resistance to wilting by Phytophthora (Phillips et al., 1987). On the other hand, plants inoculated with strain A8a (treatments B and BPc) presented a greater accumulation of tannins in the cortex than noninoculated plants (treatments C and Pc, respectively). The accumulation of phenolic compounds in plant tissues as a positive effect of the inoculation of biocontrol agents has been shown in other pathosystems. For example, Javed et al. (2021) described that inoculation with Bacillus megaterium and Pseudomonas fluorescens increased the deposition of phenolic compounds in vascular sections of stems and roots in mung bean plants (Vigna radiata) infected by Macrophomina phaseolina, which prevented the colonization of the mycelium in the lumen of the xylem vessels, unlike the plants not treated with these bacteria. The observation of a higher density of tannins in the histological cortex crosssections from the treatments inoculated with Bacillus sp. A8a suggests an action of the biocontrol agent on one of the first physical barriers of the plant’s defense and its possible contribution in the tolerance of the avocado plants against wilting by Phytophthora. However, future research should focus on elucidating the mechanisms that regulate the biocontrol capacity of strain A8a.
Conclusions
This work confirms the biocontrol activity of Bacillus sp. A8a against wilting by Phytophthora, which was previously reported in vitro, and suggests that this activity may be partly due to the differential accumulation of tannins in the cortex of the plants inoculated with the bacteria. Future studies may confirm the biocontrol potential of Bacillus sp. A8a in field conditions. Finally, to maximize its efficiency in the field, it is critical to corroborate the successful colonization of the P. americana rhizosphere by strain A8a and to improve our understanding of its interactions with the native microbiota in the avocado rhizosphere, in order to contribute to a more sustainable integrated management of wilting by Phytophthora.
Acknowledgments
This study was funded by project FOSECSEPCONAHCYT no. A1S30794. Our thanks also go to CONAHCYT for their support in the form of a postdoctoral scholarship granted to the main author (“Estancias Posdoctorales por México” Program no. 417707). We are grateful to Silvana Martén Rodríguez for facilitating the use of the greenhouse; to Alejandro Méndez Bravo and Yareli Pérez Bautista for their support during sampling; to Marlene Díaz Celaya for her technical support in the release of P. cinnamomi zoospores and to Gerardo Rodríguez Alvarado for his contribution in the isolation of the P. cinnamomi strain.