rmfiRevista mexicana de fitopatologíaRev. mex. fitopatol0185-33092007-8080Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C.10.18781/R. MEX.FIT.2401-5ArticlesComposición química de hidrolatos de Tagetes y evaluación in vitro e in vivo contra hongos asociados a enfermedades en fresa (Fragaria xananassa)Ruíz-GonzálezMiguel Ángel1Serrato-CruzMiguel Ángel2Valadez-MoctezumaErnestina3Solano-VidalRoney4Universidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Chapingo, Estado de México, México. 1Universidad Autónoma ChapingoUniversidad Autónoma ChapingoEstado de MéxicoMexicoUniversidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Chapingo, Estado de México, México.2Universidad Autónoma ChapingoUniversidad Autónoma ChapingoEstado de MéxicoMexicoUniversidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Chapingo, Estado de México, México.3Universidad Autónoma ChapingoUniversidad Autónoma ChapingoEstado de MéxicoMexicoUniversidad Autónoma Chapingo. km 38.5 Carretera México-Texcoco. 56230, Chapingo, Estado de México, México.4Universidad Autónoma ChapingoUniversidad Autónoma ChapingoEstado de MéxicoMexico18022025Sep-Dec2024423RMEXFIT240152801202425062024Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsResumenAntecedentes / Objetivo.
Las plantas aromáticas contienen compuestos químicos con potencial para formular productos antifúngicos. El objetivo de esta investigación fue caracterizar la composición química en hidrolatos de especies de Tagetes y evaluar su efecto in vitro e in vivo contra hongos asociados a enfermedades en fresa.
Materiales y métodos.
Los hidrolatos de T. coronopifolia, T. minuta, T. parryi y T. terniflora fueron analizados mediante cromatografía de gases acoplado a detector selectivo de masas. Se evaluaron in vitro hidrolatos al 100, 75, 50 y 25 % y fungicidas comerciales Promyl contra Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Ridomil Gold contra Phytophthora capsici. En la evaluación in vivo las plantas de fresa se asperjaron con hidrolatos y 24 h después fueron inoculadas con suspensión de esporas 1 x 106. Los datos se analizaron mediante análisis de varianza y pruebas de medias de Tukey (p ≤ 0.05).
Resultados.
Los monoterpenos fueron los compuestos mayoritarios en las cuatro especies. El hidrolato de T. parryi in vitro inhibió totalmente el crecimiento de B. cinerea y fue efectivo como tratamiento preventivo en la evaluación in vivo. F. oxysporum, P. capsici y R. solani fueron menos susceptibles a todos los hidrolatos.
Conclusión.
El hidrolato de T. parryi se puede aplicar como preventivo contra B. cinerea en plantas de fresa.
En México, la superficie sembrada de fresa (Fragaria x ananassa) en el año 2018 fue de 13,562 ha y en 2022 se redujo a 7,872 ha (SIAP, 2022), esta disminución se debe a problemas fitosanitarios que afectan su producción, asociados con diferentes especies de hongos, entre ellos Fusarium oxysporum, Rhizoctonia spp. (Golzar et al., 2007), Phytophthora spp. (Serret-López et al., 2016) y Botrytis cinerea (Boddy, 2016), esta situación repercute en pérdidas de hasta 50 % de la producción (Bárcenas-Santana et al., 2019). Para el control de estos hongos, se ha recurrido principalmente al uso de agroquímicos, sin embargo, el uso y dosis inadecuadas de estos ha generado efectos negativos en el ambiente y en el humano, también los hongos han desarrollado resistencia a fungicidas, aun así, su uso se intensifica y se han vuelto indispensables para la seguridad alimentaria mundial (Zubrod et al., 2019). Esta situación ha motivado a investigadores y productores a explorar alternativas, como los extractos de plantas o compuestos derivados de las mismas que se han utilizado con éxito en el control de hongos fitopatógenos. Los extractos vegetales tienen la ventaja de contener más de un compuesto antifúngico, por lo que el desarrollo de resistencia del patógeno es menos probable si los diferentes compuestos afectan a un proceso metabólico diferente (Shuping y Eloff, 2017). Es importante considerar que en los extractos el rendimiento y la composición química es variable y depende de las condiciones climáticas, el sitio de cultivo y el tiempo de cosecha (Santos-Gomes et al., 2001; Bhat et al., 2016). Además, debido a su naturaleza volátil y a la termolabilidad de sus componentes, son muy susceptibles a la degradación (Odak et al., 2018). Por lo anterior, el conocimiento científico previo de los recursos naturales o de las condiciones de manejo, tanto en campo como en almacenamiento, resulta indispensable para el aprovechamiento sustentable local de plantas y su transformación a insumos de biocontrol de hongos fitopatógenos como una vía de sustitución de pesticidas en sistemas de producción agrícola.
Tagetes (Asteraceae) es un recurso vegetal que en México está representado aproximadamente por 35 especies, varias con potencial en el control de hongos (Serrato, 2014), los extractos acuosos de algunas especies de Tagetes se han evaluado mostrando resultados promisorios, por ejemplo, T. erecta o cempasúchil es efectivo en el control de Fusarium oxysporum (Wang et al., 2022) y Rhizoctonia solani (Espejo et al., 2010), en tanto que in vitro, el aceite esencial de T. lemmoni o rudilla inhibe totalmente el crecimiento micelial de B. cinerea (Larios-Palacios et al., 2020). Durante el proceso de hidrodestilación de plantas aromáticas se obtiene un extracto acuoso conocido como hidrosol, agua aromática, hidroflorato o hidrolato, su obtención es rápida, barata y se caracteriza por contener aceite esencial en concentraciones bajas (< 1 mL L-1), además de algunos componentes de aceite polares, oxigenados e hidrófilos que forman enlaces de hidrógeno con el agua (Tisserand y Young 2014; Labadie et al., 2016; Taglienti et al., 2022). Los hidrolatos se utilizan en perfumería, cosmética, como saborizantes de alimentos, aromaterapia y terapias tradicionales (Rajeswara, 2013). Los estudios sobre el efecto biológico de los hidrolatos aún son limitados en comparación con los realizados con aceites esenciales (Yann-Olivier et al., 2018). En el área agrícola, se han usado con éxito hidrolatos de Ocimum basilicum, Cuminum cyminum, Echinophora tenuifolia, Daucus carota subsp. sativus, Rosmarinus officinalis y Satureja hortensis para controlar algunos hongos fitopatógenos como Alternaria citri, Alternaria mali, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp tulipae, Penicillium expansum y Rhizoctonia solani (Boyraz y Özcan, 2005; Boyraz y Özcan, 2006; Zatla et al., 2017). Por mucho tiempo, a los hidrolatos se les ha definido como productos de desecho de la hidrodestilación, pero en la actualidad se empiezan a utilizar como una alternativa para controlar hongos fitopatógenos. Por ello, la exploración y evaluación de otras especies aromáticas en el control de hongos de alta incidencia en cultivos como la fresa es indispensable. Considerando que Tagetes es un recurso natural abundante en México y, por lo tanto, fuente potencial de hidrolato como insumo para el biocontrol de hongos fitopatógenos, el objetivo de esta investigación fue caracterizar la composición química en hidrolatos de especies de Tagetes y evaluar su efecto in vitro e in vivo contra hongos asociados a enfermedades en fresa.
Materiales y Métodos
Muestreo vegetal. En el campo experimental de la Universidad Autónoma Chapingo (19.491733, -98.873179), en el mes de mayo de 2022 bajo condiciones de invernadero se cultivaron plantas de Tagetes: T. coronopifolia, T. minuta, T. parryi y T. terniflora, las cuales en etapa de floración fueron recolectadas en el mes de octubre y con tijeras de poda se cortaron en segmentos de 2 cm aproximadamente. La cantidad de 4 kg de una mezcla de flores (25 %), hojas (35 %) y tallos (40 %) se introdujo en matraz de destilador tipo italiano y posteriormente se agregaron 2 L de agua potable, se encendió el termostato (135±5 °C) y durante 40 min se hizo la hidrodestilación (Uddin et al., 2023). Se obtuvieron 400 mL kg-1 de hidrolato fresco, se depositó en frascos de plástico y se conservó a una temperatura de 4 °C hasta su uso. Tres especímenes de cada especie fueron ingresados al Herbario Jorge Espinoza Salas de la Preparatoria Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo con números de registro 36282, 36280, 33299 y 36281, respectivamente.
Identificación de compuestos químicos. Los hidrolatos se analizaron en un Cromatógrafo de Gases (CG) Agilent 7890B acoplado a Detector Selectivo de Masas (MSD) Agilent 5977A (CRO-E-003) y equipado con una columna DB-WAX Ultra Inert 60 m x 250 μm x 0.25 μm. La rampa de temperatura fue 40 °C por 1 min hasta 240 °C a una velocidad de 9 °C min-1. Se utilizó helio como gas acarreador a un flujo de 1 mL min-1 durante los 24 min que duró la corrida. Los hidrolatos se filtraron en un microfiltro de PTFE de 45 μm, enseguida, se disolvieron 100 μL de la muestra en 400 μL de diclorometano grado HPLC, el extracto se concentró hasta un volumen de 1 mL y se inyectó 1 μL al cromatógrafo de gases en modo splitless. Los compuestos se identificaron con base en los patrones de fragmentación de los espectros de masas, los cuales se compararon con los espectros de masas depositados en la base de datos del NIST 14 (National Institute of Standards and Technology) y la base de datos de fragancias Flavor (Agilent Technologies). Se realizó la determinación de los índices de retención de Kovats con alcanos C7-C40 (Sigma-Aldrich). Los índices de retención de Kovats experimentales se compararon con los índices de Kovats de la literatura (NIST:webbok.nist.gov/chemistry/) considerando que el índice de Kovats experimental coincidiera (± 50 unidades) con el de la literatura para la identificación correcta del compuesto. La abundancia relativa de cada compuesto se estimó con base en el área de los picos.
Procedencia de los hongos. Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici y Rhizoctonia solani fueron aislados a partir muestras de chile manzano (Capsicum pubescens) recolectadas en una plantación de chile manzano ubicado en el campo experimental agrícola Chapingo y Botrytis cinerea se aisló a partir de muestras de flores de rosa silvestre (Rosa sp.) recolectadas en el municipio de Acaxochitlán, Hidalgo. El tejido vegetal fue desinfestado con hipoclorito de sodio al 1 % y lavado tres veces con agua bidestilada, después, en medio de cultivo Agar Dextrosa y Papa (PDA) (BD Bioxon) se colocaron fragmentos de 5 mm del tejido vegetal para aislar los hongos y el oomiceto se aisló en medio de cultivo que contenía 20 g de harina de maíz, 18 g de agar-agar, 0.8 mL de pimaricina, 0.02 g de rifamicina y 0.25 g L-1 de ampicilina diluida en agua destilada. Las cajas Petri se dejaron a temperatura ambiente y fueron monitoreadas cada 24 h hasta observar crecimiento micelial. A las 72 h, se observó crecimiento y se transfirió inoculo a nuevo medio de cultivo para obtener cultivos puros. Después, F. oxysporum, R. solani y el oomiceto P. capsici fueron identificados mediante su morfología (Nelson et al., 1983; Gutiérrez et al., 2006; Leslie y Summerell, 2006; Plancarte et al., 2017). B. cinerea también se identificó mediante su morfología y con pruebas de patogenicidad en frutos de fresa (Barnett y Hunter, 1986; Terrones-Salgado et al., 2019); además, se hizo extracción de ADN con método SDS (Dodecil Sulfato Sódico), después se hizo amplificación en PCR utilizando iniciadores NL4 y ITS5HP (Toju et al, 2012; Hudagula et al., 2022). El programa térmico se fijó a 94 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos a 94 56 72 °C durante 1 1 2.3 s, respectivamente y una extensión final a 72 °C durante 10 min. Los productos amplificados de las reacciones de PCR fueron separados por electroforesis utilizando geles de agarosa al 1.2 %. Los fragmentos amplificados y purificados se enviaron a Macrogen para la secuenciación. Las secuencias en formato FASTA se compararon con la base de datos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), con lo cual se corroboró la identidad del hongo y el número de acceso en GenBank para B. cinerea es PP401673.1. Para la identificación molecular de los otros organismos, la extracción de ADN se hizo con el método CTAB (Weising et al., 2005) con modificaciones, el micelio se obtuvo de cajas Petri con crecimiento de F. oxysporum, P. capsici y R. solani y se colocó en morteros, se agregó nitrógeno líquido y el micelio se maceró con pistilo estéril. En tubos Eppendorf de 2 mL se agregó 1 mL de CTAB 2 % + 0.2 % β-mercaptoetanol y se agregó el micelio macerado, se agitó por inmersión, se incubó a 55 °C en termoblok durante 20 min con agitación cada 5 min. Posteriormente, los tubos se centrifugaron durante 5 min a 12,000 x g, con micropipetas se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo y se agregaron 1.2 volumen de isopropanol al 100 %, se agitó por inmersión y se llevaron a centrifugar durante 10 min a 12,000 x g, se descartó el sobrenadante y se hizo un lavado con etanol al 70 %, los tubos con el ADN precipitado se centrifugaron durante 10 min a 12,000 x g y al final se decantó el etanol, los tubos se colocaron invertidos sobre papel absorbente hasta que el pellet se secó, finalmente a cada tubo se le adicionaron 50 µL de TE y se mantuvieron a -20 durante 24 h. La concentración de ADN se determinó en un espectrofotómetro a 260 nm en un Nanodrop V3.5.2 (Coleman Technologies Inc. For Nanodrop Technologies). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen final de 25 µL, se usaron iniciadores NL4-ITS5SHP, ITS4-ITS5HP, ITS1-NL4, ITS1-ITS4B para amplificar la región (Toju et al., 2012; Hudagula et al., 2022), iniciadores NMSI-NMS2 para amplificar la subunidad pequeña del ribosoma y los iniciadores EF1-EF2 (Raja et al., 2017; Deng et al., 2022) para amplificar el gen TEF. Las condiciones de PCR para la región ITS y subunidad pequeña del ribosoma fueron las siguientes: un primer ciclo de pre-desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 1 min, alineamiento a 58 °C durante 45 segundos y extensión a 72 °C durante 1 min y finalmente con una extensión a 72 °C durante 10 min. Las condiciones de PCR para TEF fueron: un primer ciclo de pre-desnaturalización a 95 °C durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 1 min, alineamiento a 55 °C durante 45 s y extensión a 72 °C durante 1.5 min y finalmente con una extensión a 72 °C durante 10 min. El producto de amplificación por PCR se visualizó en electroforesis, se preparó un gel de agarosa al 1.2 % con buffer TAE 1x, corrido a 100 volts durante 1h. Para el revelado de bandas, el gel se tiñó con bromuro de etidio durante 15 min, después se visualizó con software Qwanty One (BioRad). El tamaño de las bandas se estimó tomando como referencia los marcadores de peso molecular 1 kb (Invitrogen) que fueron colocadas en los extremos. Los productos amplificados se conservaron a 4 °C para su análisis. Los fragmentos amplificados y purificados se enviaron a Macrogen para la secuenciación. Las secuencias en formato FASTA se compararon con la base de datos BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), con lo cual se corroboró la identidad de los hongos, después se hizo el registro en la base datos del GenBank. El número de registro para cada hongo es: F. oxysporum (PP729638.1), R. solani (PP713022.1) y P. capsici (PP922286.1).
Evaluación in vitro. Se preparó medio PDA mezclado con hidrolato en cuatro concentraciones (100, 75, 50 y 25 % v/v) por cada especie, las concentraciones del hidrolato se prepararon mediante diluciones con agua bidestilada y se obtuvieron 16 tratamientos de hidrolato y el testigo con PDA. Como testigos de referencia se usaron fungicidas comerciales de la Distribuidora Técnica Industrial, S. A. de C.V. y Syngenta Agro, S.A de C.V. distribuidos en Artículos Entomológicos S. A. de C. V. Texcoco. Promyl (Benomilo: Metil 1-(butilcarbamoil) bencimidazol-2-ilcarbamato) se usó para Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani y Fusarium oxysporum (Vega-López y Granados-Montero, 2023) y Ridomil Gold (N-(metoxiacetil)-N(2,6-xilil)-D-alaninato de metilo) para Phytophthora capsici (Pons-Hernández et al., 2020). De cada fungicida se usó 1.5 g L-1. Después de preparar el medio de cultivo, en el centro de cada caja Petri que contenía el medio de cultivo combinado con hidrolato se colocó un disco (3.5 mm) con micelio de cada hongo (colonias de 10 días de edad) y después se incubaron en condiciones de oscuridad con las siguientes temperaturas: B. cinerea a 20 °C, P. capsici a 27 °C, F. oxysporum y R. solani a 30 °C. Cada 24 h se midió el crecimiento radial con un vernier digital.
Evaluación in vivo. Solo los tratamientos que tuvieron el mayor efecto de inhibición en condiciones in vitro se retomaron para su evaluación in vivo. La evaluación se hizo en un invernadero y se usaron plantas de fresa var. “FESTIVAL” provenientes de Zamora, Michoacán de cinco meses de edad en fase de floración mantenidas en maceta con tezontle rojo; la fertilización se hizo con solución Steiner al 100 % con riegos semanales y con aplicación semanal de fertilizante foliar PEKA® (1 mL L-1) (Producto elaborado por Química Sagal y distribuido en Agroquímicos Texcoco S.A. de C. V.). Cuando las plantas estaban en fructificación, se seleccionaron cuatro frutos maduros a los que se les hizo solo una perforación de 0.2 cm de profundidad con aguja de disección esterilizada con alcohol y a cada planta se le asperjaron 20 mL de hidrolato con atomizador, 24 h después de la aplicación de hidrolatos se inocularon las plantas con una suspensión de esporas 1 x 106 de F. oxysporum y B. cinerea preparada con agua bidestilada y 1 mL L-1 de Tween 20, la aplicación de las esporas se hizo con atomizador, P. capsici y R. solani se inocularon mediante micelio. Las plantas inoculadas se cubrieron con una bolsa de polietileno durante 48 h para mantener la humedad, posteriormente, las hojas, frutos maduros, frutos inmaduros y flores fueron monitoreadas cada 24 h hasta las 72 h para la detección de síntomas causados por los patógenos (B. cinerea, F. oxysporum, P. capsici y R. solani).
Diseño experimental y análisis de datos. El experimento in vitro se analizó bajo un Diseño Completamente al Azar (DCA) con cinco repeticiones cada uno, una caja Petri fue una unidad experimental. Con los datos del crecimiento radial se calculó el porcentaje de inhibición (Kagezi et al., 2015). El experimento in vivo se hizo con un DCA, se usaron cuatro macetas por tratamiento, una maceta fue considerada una unidad experimental, con los datos registrados sobre los frutos y flores enfermos y no enfermos se estimó la incidencia de la enfermedad (Macías et al., 2016). Los datos se sometieron a un análisis de varianza y pruebas de medias de Tukey (p ≤ 0.05) en Software académico SAS.
Resultados y Discusión
Compuestos químicos. En el hidrolato de T. parryi se identificaron 14 compuestos, en T. minuta 13, en T. coronopifolia 11 y un total de 9 en T. terniflora (Figura 1). En el hidrolato de T. parryi, los compuestos mayoritarios fueron el 3-Hexen-1-ol (25.5 %), isopiperitanona (14.9 %), 1,3-Di-terc-butilbenceno (6.1 %) y α-terpineol (5.9 %) (Cuadro 1). Al realizar una comparación con compuestos encontrados en aceite esencial de la misma especie, Díaz-Cedillo y Serrato-Cruz (2011) identificaron siete compuestos principales: canfeno, 3, 6, 6-trimetil2-norpinanol, anisol, 4-isopropil-1-metil-2-ciclohexenol, cineol, eugenol y α-terpineol y González-Velasco et al. (2022) registraron 21 compuestos, entre ellos, verbenona, dihidrotagetona, tagetona, eugenol y α-terpineol, la mayoría de estos compuestos son monoterpenos y sesquiterpenos. En el hidrolato de T. parryi únicamente el α-terpineol y la dihidrotagetona fueron similares a lo reportado en aceite esencial, por lo que gran parte de los compuestos resultaron diferentes de lo consignado para el aceite esencial. En el hidrolato de T. coronopifolia se encontró dihidrotagetona (53.9 %), cis-tagetona (11.9 %), (Z)-tagetenona (9.7 %) y trans-tagetona (5.9 %) (Cuadro 1); ningún compuesto encontrado en la muestra de hidrolato coincidió con lo reportado para el aceite esencial por Díaz-Cedillo et al. (2013): (1S) -6,6-dimetil-2-metilenbiciclo [3.1.1] heptan-3-ona, verbenona, 2-oxo-decanoato de metilo y crisantenona. En hidrolato de T. terniflora la dihidrotagetona (45 %), eucaliptol (13.2 %), trans-3-Hexen-1-ol (10.8 %) y cis-tagetona (4.5 %) (Cuadro 1) fueron los mayoritarios. Solo el compuesto cis-tagetona fue común en el aceite esencial e hidrolato analizado (Lizarraga et al., 2017).
Cromatogramas de hidrolatos de <italic>Tagetes parryi</italic> (Tp), <italic>T. terniflora</italic> (Tt), <italic>T. coronopifolia</italic>, (Tc) y <italic>T. minuta</italic> (Tm), donde se observan los picos de los compuestos identificados.
Abundancia relativa (%) e índices de Kovats (IK) ± desviación estándar de compuestos químicos encontrados en
T. parryi
%
IK
T. coronopifolia
%
IK
°
3-Hexen-1-ol, (E)-
25.5
1370 ± 18.5
+
Dihidrotagetona
53.9
1319 ± 3.3
+
Isopiperitenona
14.9
1833 ± 41.9
+
Cis-tagetona
11.9
1500 ± 23.1
-
1,3-Di-terc-butilbenceno
6.1
1426 ± 9.5
+
(Z)-tagetenona
9.7
1704 ± 9.5
+
α-terpineol
5.9
1700 ± 14.8
+
Trans-tagetona
5.9
1522 ± 8.2
+
(Z)-tagetenona
4.5
1704 ± 24.4
*
10,11-tetradecadianoato de metilo
1.6
1663 ± 19.8
+
Cis-tagetona
3.2
1517 ± 10.7
*
Cariofileno
1.2
1585 ± 33.5
*
10,11-tetradecadianoato de metilo
2.3
1663 ± 19.8
+
2 -( 3 - metil- 2 - ciclopens- 1 - i l )- 2 - metilpropionaldehído
En el hidrolato de T. minuta el compuesto mayoritario fue el 3-Hexen-1-ol (16.4 %), benceno, 1,3-bis(1,1-dimetiletil)(14.6 %), cis-tagetona (10.1 %) y dihidrotagetona (5.6 %) (Cuadro 1). Solo la dihidrotagetona fue común con lo que reportan Karimian et al. (2014) para esta especie cuyo aceite esencial contiene compuestos como: dihidrotagetona, E-ocimeno, tagetona, cis-β-ocimeno, Z-ocimeno, limoneno y epoxiocimeno. Los compuestos 3-Hexen-1-ol, (E)-, dihidrotagetona y cis-tagetona fueron comunes en los hidrolatos de las especies de Tagetes en estudio (Cuadro 1), mientras que, al comparar la composición química de los hidrolatos con la de aceites esenciales, estos no coinciden en compuestos ni en abundancia, por lo que la composición química de hidrolatos y aceites esenciales siempre es diferente, cuantitativa y cualitativamente (D’Amato et al., 2018). En otros estudios se ha encontrado que tanto en hidrolatos como en los aceites esenciales los monoterpenos y los monoterpenos oxigenados son abundantes, pero no se encuentran los mismos compuestos (Vuko et al., 2021). Inouye et al. (2008) compararon 43 hidrolatos con aceites esenciales obtenidos de mismo proceso de destilación al vapor y encontraron que 18 de los 43 hidrolatos analizados mostraron un componente mayoritario diferente al del aceite. Los aceites esenciales de Tagetes son ricos en monoterpenos, además de cantidades bajas de sesquiterpenos y compuestos oxigenados (Salehi et al., 2018). En este estudio, los compuestos mayoritarios en las cuatro especies pertenecen a monoterpenos y en menor cantidad a sesquiterpenos, compuestos fenólicos y algunos alcoholes (Cuadro 1). Aunque ya se tenía información sobre la composición de hidrolatos de dos especies de América del Sur (Rajeswara et al., 2006; Lima et al., 2009), la identificación de los compuestos en hidrolatos de las cuatro especies de Tagetes de México constituyen otro antecedente importante para avanzar en el conocimiento fitoquímico del género.
Evaluación in vitro. Los tratamientos evaluados mostraron efectos inhibitorios significativos sobre B. cinerea (p < 0.0001), F. oxysporum (p < 0.0053), P. capsici (p < 0.0001) y R. solani (p < 0.0001) (Cuadro 2). El hidrolato al 100 % de T. parryi inhibió el crecimiento micelial de B. cinerea en 71.3 %, sin diferencia estadística respecto al efecto producido por el fungicida comercial, incluso, diluciones de este hidrolato en 50 y 75 % mostraron diferencias estadísticas con el testigo; mientras que, con hidrolato al 100 % o diluido de las otras especies de Tagetes, la inhibición del micelio fue menor a 40 %, en la mayoría, sin diferencia estadística respecto del testigo (Cuadro 2). En P. capsici, el hidrolato de T. coronopifolia al 75 y al 100 % fue efectivo para inhibir totalmente el crecimiento micelial, al igual que el fungicida; con hidrolatos de T. minuta, T. parryi y T. terniflora en diluciones de 50 y 75 % la inhibición de P. capsici fue significativa (p < 0.0001) con respecto al testigo, pero no respecto al fungicida. Ninguna concentración de los hidrolatos evaluados mostró un efecto fungistático contra F. oxysporum y R. solani. Los hidrolatos de T. minuta, T. parryi y T. terniflora inhibieron estos hongos en 26.6 %, en el caso de T. coronopifolia al 100 %, se inhibió a F. oxysporum y R. solani en 25 y 34.4 %, respectivamente (Cuadro 2). El efecto inhibitorio de los aceites esenciales e hidrolatos es debido a los monoterpenos, sesquiterpenos y compuestos fenólicos (Hu et al., 2019; Hill, 2022). Los monoterpenos son pequeños y pasan entre las moléculas grasas que forman la membrana celular y afectan funciones dentro de la célula, mientras que los sesquiterpenos no son tan pequeños para pasar por la membrana celular, pero tienen formas únicas que les permiten adherirse a los espacios
Porcentaje de inhibición <italic>in vitro</italic> de micelio de hongos después de la aplicación de hidrolatos de especies de <italic>Tagetes</italic>.<inline-graphic xlink:href="2007-8080-rmfi-42-03-RMEXFIT24015-i002.gif"/>
Tratamientos
Inhibición (%) del micelio de los hongos
B. cinerea
P. capsici
F. oxysporum
R. solani
TO
0 ± 0 e
0 ± 0 f
0± 0 c
0 ± 0 c
FC
100 ± 0 a
100 ± 0 a
100 ± 0 a
100 ± 0 a
H100C
40 ± 28.8 bcde
100 ± 0 a
25 ± 15.5 b
34.4 ± 22.2 b
H100M
35 ± 21.6 bcde
54.3 ± 2.5 b
21 ± 4.5 bc
20 ± 11.7 bc
H100P
71.3 ± 9.7 ab
55.3 ± 3 b
23 ± 4 b
26.6 ± 6.8 bc
H100T
25.3 ± 15 cde
57 ± 13.1 b
16.6 ± 2 bc
20 ± 2.6 bc
H75C
22.6 ± 23.5 cde
100 ± 0 a
16.6 ± 3.5 bc
32.6 ± 13.2 bc
H75M
34 ± 7.9 bcde
43.3 ± 9 bc
18.6 ± 7.6 bc
15.6 ± 6 bc
H75P
54.6 ± 18.9 bc
38.3 ± 10.4 bcd
12.3 ± 7 bc
17 ± 13.5 bc
H75T
14 ± 17.8 cde
38.3 ± 3 bcd
11.3 ± 10.5 bc
20 ± 11.5 bc
H50C
22.6 ± 2.3 cde
61.6 ± 20.4 b
9.1 ± 9.4 bc
19.6 ± 10.4 bc
H50M
25 ± 4.5 cde
27 ± 3.6 cde
16 ± 7.9 bc
10.6 ± 8.8 bc
H50P
54 ± 10.5 bcd
28.3 ± 8.5 cde
10.6 ± 6.5 bc
14.3 ± 7.5 bc
H50T
10.3 ± 24.2 de
17 ± 11.7 def
6.3 ± 7.57 bc
10 ± 12.6 bc
H25C
4.6 ± 5.6 e
10.3 ± 11.6 ef
1 ± 1 c
11.6 ± 18 bc
H25M
3.6 ± 6.3 e
16 ± 5 def
10.6 ± 7.5 bc
10 ± 10.7 bc
H25P
33.3 ± 7 bcde
13 ± 3 ef
9.3 ± 3 bc
13 ± 4.5 bc
H25T
0 ± 0 e
4.6 ± 8 ef
4 ± 4 bc
8.4 ± 0 bc
Valor p
0.0001
0.0001
0.0053
0.0001
CV
33
14
21
30
DMS
41
23
39
30
TO: Testigo, FC: Fungicida comercial, H: Hidrolato, 100, 75, 50 y 25: Concentración (%) de hidrolato usada, C: T. coronopifolia, M: T. minuta, P: T. parryi, T: T. terniflora, CV: Coeficiente de variación, DMS: Diferencia mínima significativa, Medias con letras diferentes entre las columnas son estadísticamente diferentes (Tukey, 0.05). Los valores promedio ± desviación estándar.
de estructuras proteínicas tridimensionales y afectan la actividad proteínica (Hill, 2022). Hu et al. (2019) mencionan que los compuestos fenólicos pueden interferir con las membranas, las paredes celulares y la acción de las enzimas. En el hidrolato de T. parryi se encontró una mayor diversidad de grupos de compuestos, entre estos se encontró el compuesto fenólico 1,3-Di-terc-butilbenceno (Cuadro 1). Al respecto, Zatla et al. (2017) mencionan que los compuestos fenólicos de Daucus carota subsp. sativus tienen actividad antifúngica contra B. cinerea. Belabbés et al. (2017) atribuyen el efecto antifúngico contra Penicillium expansum a los sesquiterpenos oxigenados encontrados en el hidrolato de Calendula arvensis. En T. parryi, T. coronopifolia y en T. minuta se encontró el sesquiterpeno 11-tetradecadianoato de metilo con una abundancia relativa entre 1.6 y 2.5 % (Cuadro 1) y el efecto inhibitorio de estos hidrolatos fue mayor (Cuadro 2) a lo observado con T. terniflora, que no contenía este compuesto. También, los aceites con abundancia de monoterpenos inhiben el crecimiento de hongos (Stević et al., 2014), lo que permite resaltar que los hidrolatos de Tagetes analizados tienen abundantes monoterpenos (Cuadro 1). Aunque el efecto antifúngico se atribuye a los compuestos mayoritarios, es el efecto sinérgico de todos los compuestos los que causan los efectos antifúngicos y también algunos compuestos son más activos que otros (Dhifi et al., 2016).
Evaluación in vivo. Los tratamientos con hidrolatos al 100 % de las cuatro especies de Tagetes mostraron la mayor inhibición in vitro (Cuadro 2), por ello, se retomaron para su evaluación in vivo. Las plantas de fresa no mostraron efecto fitotóxico debido a la aplicación de los hidrolatos de Tagetes, lo cual da buena expectativa para futuras evaluaciones en otras especies vegetales. Las plantas testigo inoculadas con B. cinerea presentaron síntomas de la enfermedad, tanto en frutos como en flores. Por otro lado, las plantas inoculadas con F. oxysporum, P. capsici y R. solani no mostraron síntomas de enfermedad en las flores, pero sí en el fruto perforado (Figura 2). Los frutos de fresa son muy perecederos, además, si el fruto presenta algún daño mecánico o lesión facilita la infección por patógenos (Ángel-García et al., 2018); la falta de incidencia de la enfermedad en flores posiblemente esté relacionada con la ausencia de lesión y porque estos hongos afectan principalmente las raíces, la corona y frutos (Koike y Gordon, 2015; Awad, 2016; Barboza et al., 2016). El hidrolato de T. parryi fue efectivo como tratamiento preventivo contra B. cinerea, debido a que los frutos perforados (Figura 2A) y las flores (Figura 2B) no presentaron incidencia del hongo, por tal motivo, este hidrolato, representa un insumo alternativo a los fungicidas químicos que tienen efectos negativos en el ambiente y han inducido resistencia en este hongo (Leroux, 2004). Zatla et al. (2017) evaluaron el efecto del hidrolato de Daucus carota subsp. sativus en frutos de fresa y este fue efectivo como tratamiento preventivo al inhibir totalmente a B. cinerea hasta el quinto día, estos autores atribuyen el efecto a la abundancia de compuestos fenólicos. Por ello, el efecto observado con el hidrolato de T. parryi también puede atribuirse al compuesto fenólico 1,3-Di-terc-butilbenceno en conjunto con los otros monoterpenos mayoritarios y sesquiterpenos encontrados en el hidrolato (Cuadro 1). Por otra parte, con la aplicación del hidrolato de T. terniflora en los frutos (Figura 2A) no se observaron síntomas de la enfermedad, pero las flores sí se infectaron y con el hidrolato de T. minuta se observó un efecto contrario, las flores no se infectaron y los frutos sí fueron infectados por el hongo (Figura 2B); con este resultado se contempla que una aplicación conjunta de estos hidrolatos podría ser efectiva contra este hongo. El hidrolato de T. coronopifolia no funcionó como tratamiento preventivo.
Incidencia de <italic>B. cinerea, R. solani, F. oxysporum</italic> y <italic>P. capsici</italic> en frutos (A) y flores (B) de fresa a los tres días posteriores a su inoculación en plantas testigo (TO) y sometidas a tratamientos con hidrolatos al 100 % de <italic>Tagetes coronopifolia</italic> (H100C), <italic>T. minuta</italic> (H100M), <italic>T. parryi</italic> (H100P) y <italic>T. terniflora</italic> (H100T).
Conclusiones
Los hidrolatos de las especies de Tagetes ensayadas contienen entre 46 y 72 % de monoterpenos y en menor cantidad algunos alcoholes (0-33 %), sesquiterpenos (0-27 %) y compuestos fenólicos (0-8 %). Aunque en la evaluación in vitro se observó efecto fungistático con algunos hidrolatos, este efecto no se mantuvo en la aplicación in vivo, solo la aplicación del hidrolato de T. parryi es efectivo como tratamiento preventivo contra B. cinerea en plantas de fresa en floración y fructificación.
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Aromatic plants contain chemical compounds with potential to formulate antifungal products. The objective of this study was to characterize the chemical composition in hydrolates of Tagetes species and to evaluate their effect in vitro and in vivo against disease-associated fungi in strawberry.
Materials and Methods.
The hydrolates of T. coronopifolia, T. minuta, T. parryi and T. terniflora were analyzed by gas chromatography coupled to a mass spectrometry. Hydrolates at 100, 75, 50 and 25 % and Promyl commercial fungicides were evaluated in vitro against Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Ridomil Gold against Phytophthora capsici. In the in vivo evaluation, strawberry plants sprayed with the hydrolates and 24 h later the plants were inoculated with 1 x 106 spore suspension. Data were analyzed by analysis of variance and Turkey’s means test (p ≤ 0.05).
Results.
Monoterpenes were the major compounds in the four Tagetes species. T. parryi hydrolate in vitro totally inhibited the growth of B. cinerea being effective as a preventive treatment in the in vivo evaluation. F. oxysporum, P. capsici and R. solani were less susceptible to all the hydrolats.
Conclusion.
T. parryi hydrolate can be applied as a preventative against B. cinerea on strawberry plants.
In Mexico, the surface planted with strawberries (Fragaria x ananassa) in 2018 was 13,562 ha and in 2022 it decreased to 7,872 ha (SIAP, 2022). This reduction was due to phytosanitary problems that affect their production, associated with different species of fungi, including Fusarium oxysporum, Rhizoctonia spp. (Golzar et al., 2007), Phytophthora spp. (Serret-López et al., 2016) and Botrytis cinerea (Boddy, 2016). This situation results in losses of up to 50% of the production (BárcenasSantana et al., 2019). To control these fungi, agrochemicals have mainly been used; however, their improper use and dosage has had negative effects on the environment and on humans. Moreover, fungi have developed resistance to fungicides, although their use has intensified and they have become crucial for global food security (Zubrod et al., 2019). This situation has led researchers and producers to explore alternatives, such as plant extracts or compounds derived from them, which have been successfully used to control phytopathogenic fungi. Plant extracts have the advantage of containing more than one antifungal compound, making pathogen resistance less likely if the different compounds affect a different metabolic process (Shuping and Eloff, 2017). It is important to consider that in the extracts, the yield and chemical composition are variable and depend on weather conditions, cultivation site and time of harvest (Santos-Gomes et al., 2001; Bhat et al., 2016). In addition, due to the volatile nature and thermolability of their components, they are very susceptible to degradation (Odak et al., 2018). Therefore, prior scientific knowledge of natural resources or management conditions, both in the field and in storage, is essential for the sustainable local use of plants and their transformation into biocontrol inputs for phytopathogenic fungi as a way to replace pesticides in agricultural production systems. Tagetes (Asteraceae) is a plant resource, represented in Mexico by approximately 35 species, several of which have the potential to control fungi (Serrato, 2014). The aqueous extracts of some Tagetes species have displayed promising results, such as T. erecta or the Mexican marigold, is effective in the control of Fusarium oxysporum (Wang et al., 2022) and Rhizoctonia solani (Espejo et al., 2010), whereas in vitro, the T. lemmoni or Lemmon’s marigold essential oil completely inhibits the mycelial growth of B. cinerea (Larios-Palacios et al., 2020). During the process of hydrodistillation of aromatic plants, an aqueous extract known as hydrosol, aromatic water, hydroflorate or hydrolate. Its extraction is quick, inexpensive and characteristically contains low concentrations of essential oil (< 1 mL L-1), as well as some polar, oxygenated and hydrophyllic oil components that for hydrogen bonds with water (Tisserand and Young 2014; Labadie et al., 2016; Taglienti et al., 2022). Hydrolates are used in perfumes, cosmetics, as food flavorings, aromatherapy and traditional therapies (Rajeswara, 2013). Studies on the biological effect of hydrolates are still limited in comparison with those performed on the biological effect of essential oils (Yann-Olivier et al., 2018). In the scope of agriculture, Ocimum basilicum, Cuminum cyminum, Echinophora tenuifolia, Daucus carota subsp. sativus, Rosmarinus officinalis and Satureja hortensis have been successfully used to control some phytopathogenic fungi such as Alternaria citri, Alternaria mali, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp tulipae, Penicillium expansum and Rhizoctonia solani (Boyraz and Özcan, 2005; Boyraz and Özcan, 2006; Zatla et al., 2017). For a long time, hydrolates have been defined as waste products of hydrodistillation, but currently, they are beginning to be used as an alternative to control phytopathogenic fungi. Therefore, the exploration and evaluation of other aromatic species in the control of fungi with a high incidence in crops such as strawberry is essential. Considering that Tagetes is an abundant natural resource in Mexico, and thus a potential source of hydrolate as an input for the biocontrol of phytopathogenic fungi, the aim of this investigation was to characterize the chemical composition in hydrolates of Tagetes species and evaluate their effect in vitro and in vivo against diseases associated fungi in strawberry.
Materials and Methods
Plant sampling. In the experimental field of the Chapingo Autonomous University (19.491733, -98.873179), in May of 2022, under greenhouse conditions, Tagetes plants were sown: T. coronopifolia, T. minuta, T. parryi and T. terniflora, which, in flowering stage, were gathered in the month of October and, using pruning shears, were cut into segments measuring approximately 2 cm. The amount of 4 kg of a mixture of flowers (25%), leaves (35%) and stems (40 %) was introduced in a round-bottomed flask and 2 L of drinkable water were then added, the thermostat was turned on (135±5 °C) and for 40 minutes, the hydrodistillation was carried out (Uddin et al., 2023). A total of 400 mL kg-1 of fresh hydrolate were obtained, placed in plastic jars and stored at a temperature of 4 °C until use. Three specimens of each species were taken to the Jorge Espinoza Salas herbarium of the Agricultural High School, Chapingo Autonomous University, with registration numbers 36282, 36280, 33299 and 36281, respectively.
Identification of chemical compounds. The hydrolates were analyzed using an Agilent 7890B Gas Chromatograph (GC) coupled with an Agilent 5977ª Mass Selective Detector (MSD) (CRO-E-003) and equipped with a DB-WAX Ultra Inert column (60 m x 250 μm x 0.25 μm). The temperature ramp was 40 °C for 1 min up to 240 °C at a speed of 9 °C min-1. Helium was used as the carrier gas at a flow rate of 1 mL min-1 for the duration of the 24 min run. The hydrolates were filtered in a 45 μm PTFE microfilter, then 100 μL of the sample were dissolved in 400 μL of HPLC grade dichloromethane. The extract was concentrated to a volume of 1 mL and injected into the gas chromatograph in splitless mode. The compounds were identified based on the fragmentation patterns of the mass spectra, which were compared with the mass spectra in the NIST 14 (National Institute of Standards and Technology) database and the Flavor fragrance database (Agilent Technologies). The determination of Kovats retention indices was performed with the C7-C40 alkanes (Sigma-Aldrich). The experimental Kovats retention indices were compared with the Kovats indices from the literature (NIST:webbok.nist. gov/chemistry/), considering that the experimental Kovats index matched (± 50 units) with the literature for the correct identification of the compound. The relative abundance of each compound was estimated based on the area of the peaks.
Origin of the fungi. Fusarium oxysporum, Phytophthora capsici and Rhizoctonia solani were isolated from samples of manzano pepper (Capsicum pubescens) gathered in a ‘manzano pepper’ orchard located in the Chapingo experimental field, and Botrytis cinerea was isolated from samples of wild rosebushes (Rosa sp.) gathered in the municipal area of Acaxochitlán, Hidalgo. The plant tissue was disinfested with sodium hypochlorite at 1% and washed three times with biodistilled water. Later, in a Potato-Dextrose-Agar (PDA) culture medium (BD Bioxon), 5 mm fragments of the plant tissue were placed in order to isolate the fungi and the oomycete was isolated in a culture medium containing 20 g of corn flour, 18 g of agar-agar, 0.8 mL of pimaricin, 0.02 g de rifamycin and 0.25 g L-1 of ampicillin diluted in distilled water. The Petri dishes were kept at room temperature and were monitored every 24 hours until mycelial growth was observed. At 72 h, growth was observed and inoculum was transferred to a new culture medium to obtain pure cultures. Subsequently, F. oxysporum, R. solani and the oomycete P. capsici were identified based on their morphology (Nelson et al., 1983; Gutiérrez et al., 2006; Leslie and Summerell, 2006; Plancarte et al., 2017). B. cinerea was also identified based on its morphology and pathogenicity tests on strawberry fruits (Barnett and Hunter, 1986; Terrones-Salgado et al., 2019). Additionally, DNA extraction was performed using the SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) method, followed by PCR amplification using NL4 and ITS5HP primers (Toju et al., 2012; Hudagula et al., 2022). The thermal program was set to 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles at 94 - 56 - 72 °C for 1 - 1 - 2.3 s, respectively, and a final extension at 72 °C for 10 min. The amplified products of the PCR reactions were separated by electrophoresis using 1.2% agarose gels. The amplified and purified fragments were sent to Macrogen for sequencing. The sequenced in FASTA format were the BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) database, confirming the identity of the fungus, and the GenBank accession number for B. cinerea is PP401673.1. For the molecular identification of the other organisms, the DNA extraction was carried out using the CTAB method (Weising et al., 2005) with modifications. The mycelium was obtained from Petri dishes with F. oxysporum, P. capsici and R. solani growth and placed in mortars. Liquid nitrogen was added and the mycelium was macerated with a sterile pestle. In 2 mL Eppendorf tubes, 1 mL of 2% CTAB + 0.2% β-mercaptoethanol was added, followed by the macerated mycelia, it was shaken by immersion and incubated at 55 °C in a thermoblock for 20 min, stirring every 5 min. Subsequently, the tubes were centrifuged for 5 min at 12,000 x g, the supernatant was transferred to a new tube using micropipettes and 1.2 volumes of 100% isopropanol were added. It was shaken by immersion and centrifuged for 10 min at 12,000 x g, the supernatant was discarded, and washed with 70% ethanol. The tubes with precipitated DNA were centrifuged for 10 min at 12,000 x g and the ethanol was decanted. The tubes were placed upside down on absorbent paper until the pellet dried. Finally, 50 µL of TE were added to each tube, and they were kept at -20 for 24 h. The DNA concentration was determined using a spectrophotometer at 260 nm in a Nanodrop V3.5.2 (Coleman Technologies Inc. For Nanodrop Technologies). The PCR reactions were carried out in a final volume of 25 µL using primers NL4-ITS5SHP, ITS4-ITS5HP, ITS1-NL4, ITS1-ITS4B to amplify the ITS (Toju et al., 2012; Hudagula et al., 2022), primers ITS NMSI-NMS2 to amplify the small subunit of the ribosome, and primers EF1-EF2 to amplify the TEF gene (Raja et al., 2017; Deng et al., 2022). The PCR conditions for the ITS region and small ribosomal unit were as follows: a first pre-denaturation cycle at 95 °C for 5 min, followed by 35 denaturation cycles at 95 °C for 1 min, aligning at 58 °C for 45 seconds and an extension at 72 °C for 1 min; finally, an extension at 72 °C for 10 min. The PCR conditions for TEF were as follows: a first pre-denaturation cycle at 95 °C for 5 min, followed by 35 denaturation cycles at 95 °C for 1 min, aligning at 55 °C for 45 s and an extension at 72 °C for 1.5 min; finally, an extension at 72 °C for 10 min. The PCR amplification product was visualized by electrophoresis, 1.2% agarose gel was prepared with 1x TAE buffer, run at 100 volts for 1 h. For scrambling the bands, the gel was stained with ethidium bromide for 15 min, then viewed with the Qwanty One software (BioRad). The size of the bands was estimated using the 1 kb molecular weight markers (Invitrogen) placed at the ends. The amplified products were stored at 4 °C for analysis. The amplified and purified fragments were sent to Macrogen for sequencing. The sequences in FASTA format were compared with the BLAST database (Basic Local Alignment Search Tool), to confirm the identity of the fungi, and then registered in the GenBank database. The accession number for each fungus is F. oxysporum (PP729638.1), R. solani (PP713022.1) and P. capsici (PP922286.1).
In vitro evaluation. PDA medium was mixed with hydrolate in four concentrations (100, 75, 50 and 25% v/v) for every species. The concentrations of the hydrolate were prepared by diluting with bidistilled water and 16 hydrolate treatments were obtained, along with the control with PDA. As reference controls. Commercial fungicides from Distribuidora Técnica Industrial, S. A. de C. V. and Syngenta Agro, S.A de C.V., distributed by Artículos Entomológicos S. A. de C. V. Texcoco, were used. Promyl (Benomyl: Methyl 1-(butylcarbamoyl) bencimidazol-2-il-carbamate) was used for Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum (VegaLópez and Granados-Montero, 2023) and Ridomil Gold (N-(metoxiacetil)-N-(2,6xilil)-D-alaninato de metilo) for Phytophthora capsici (Pons-Hernández et al., 2020). Each fungicide was used at 1.5 g L-1. After preparing the culture medium, a disk (3.5 mm) with mycelium from each fungus (10-days-old colonies) was placed in the center of each Petri dish containing the culture medium combined with hydrolate, then incubated in dark conditions with the following temperatures: B. cinerea at 20 °C, P. capsici at 27 °C, F. oxysporum and R. solani at 30 °C. The radial growth was measured every 24 h using a digital caliper.
In vivo evaluation. Only the treatments with the highest inhibition effect in vitro were retaken for their evaluation in vivo. The evaluation was performed in a greenhouse and five-month-old “FESTIVAL” variety strawberry plants were used, from Zamora, Michoacán in the flowering phase kept in pots with red tezontle; fertilization was carried out using 100% Steiner solution, irrigating on a weekly basis and with a weekly application of foliar fertilizerPEKA® (1 mL L-1) (Product manufactured by Química Sagal and distributed by Agroquímicos Texcoco S.A. de C. V.). When the plants began bearing fruits, four mature fruits were selected, and a 0.2 cm-deep perforation was made using a dissection needle sterilized with alcohol, and each plant was sprayed with 20 mL de hydrolate; 24 h after the application of hydrolates, the plants were inoculated with a 1 x 106F. oxysporum and B. cinerea spore suspension prepared with bidistilled water and 1 mL L-1 of Tween 20. The spores were applied by spraying and P. capsici and R. solani were inoculated via mycelia. The inoculated plants were covered with a polyethylene bag for 48 h to withhold moisture, after which the leaves, mature fruits, immature fruits and flowers were monitored every 24 h until 72 h passed in order to detect symptoms caused by the pathogens (B. cinerea, F. oxysporum, P. capsici and R. solani).
Experimental design and analysis of data. The in vitro experiment was analyzed under a Completely Randomized Design (CRD) with five repetitions each; a Petri dish was an experimental unit. Using the radial growth data, the percentage of inhibition was calculated (Kagezi et al., 2015). The in vivo experiment was calculated with a CRD. Four pots were used per treatment and each pot was considered an experimental unit. The incidence of the disease was calculated using the data recorded on the diseased fruits and flowers (Macías et al., 2016). The data underwent an analysis of variance and Tukey’s means test (p ≤ 0.05) using SAS academic Software.
Results and Discussion
Chemical compounds. In the T. parryi hydrolate, 14 compounds were identified, 13 in T. minuta, 11 in T. coronopifolia and a total of 9 in T. terniflora (Figure 1). In the T. parryi hydrolate, the most abundant compounds were 3-Hexen-1-ol (25.5%), isopiperitenone (14.9 %), 1,3-Di-tert-butylbenzene (6.1%) and alphaterpineol (5.9%) (Table 1). When comparing with compounds found in this essential oil of the same species, Díaz-Cedillo and Serrato-Cruz (2011) identified seven main compounds: camphene, 3, 6, 6-trimethyl-2-norpinanol, anisole, 4-isopropyl-1-methyl-2-cyclohexenol, cineole, eugenol and alpha-terpineol and González-Velasco et al. (2022) recorded 21 compounds, including verbenone, dihydrotagetone, tagetone, eugenol and alpha-terpineol, most of which are monoterpenes and sesquiterpenes. In the T. parryi hydrolate, only alpha-terpineol and dihydrotagetone were similar to reports in essential oil, therefore most of the compounds were different to those listed for the essential oil. In T. coronopifolia hydrolate, dihydrotagetone (53.9%), cis-tagetone (11.9%), (Z)-tagetenone (9.7%) and trans-tagetone (5.9%) were found (Table 1); no compounds found in the hydrolate sample coincided with the report for the essential oil by Díaz-Cedillo et al. (2013): (1S) -6,6-dimethyl-2-methylene-bicyclo [3.1.1] heptan-3-one, verbenone, methyl 2-oxo-decanoate and crysantenone. In T. terniflora hydrolate, dihydrotagetone (45 %), eucalyptol (13.2 %), trans3-Hexen-1-ol (10.8 %) and cis-tagetone (4.5 %) (Table 1) were the most abundant. Only the cis-tagetone was common in the analyzed essential oil and hydrolate (Lizarraga et al., 2017).
In T. minuta hydrolate, the most abundant compounds were 3-Hexen-1-ol (16.4 %), benzene, 1,3-bis(1,1-dimethylethyl)(14.6 %), cis-tagetone (10.1 %) and dihydrotagetone (5.6 %) (Table 1). Only dihydrotagetone was common with what Karimian et al. (2014) reported for this species, which has an essential oil that contains compounds such as: dihydrotagetone, E-ocimene, tagetone, cis-βocimene, Z-ocimene, limonene and epoxyocimene. The compounds 3-Hexen-1-ol, (E)-, dihydrotagetone and cis-tagetone were common in the hydrolates of the species of Tagetes under study (Cuadro 1), whereas a comparison between the chemical composition of the hydrolates and of the essential oils shows that these do not coincide in compounds or in abundance,
<italic>Tagetes parryi</italic> (Tp), <italic>T. terniflora</italic> (Tt), <italic>T. coronopifolia</italic>, (Tc) and <italic>T. minuta</italic> (Tm) hydrosol chromatograms, showing the peaks of the compounds identified.
Relative abundance (%) and Kovats indices (KI) ± standard deviation of chemical compounds found in <italic>Tagetes coronopifolia</italic>, <italic>T. minuta</italic>, <italic>T. parryi</italic> and <italic>T. terniflora</italic> hydrolates analyzed using GC/MSD.
therefore the chemical composition of hydrolates and essential oils is always different, both quantitatively and qualitatively (D’Amato et al., 2018). Other studies have found that in both hydrolates and essential oils, monoterpenes and oxygenated monoterpenes are abundant, but the same compounds are not found (Vuko et al., 2021). Inouye et al. (2008) compared 43 hydrolates with essential oils obtained from the same steam distillation process and found that 18 of the 43 hydrolates analyzed displayed a different more abundant compound than the oil.
The Tagetes essential oils are monoterpene-rich, and contain low amounts of sesquiterpenes and oxygenated compounds (Salehi et al., 2018). In this study, the more abundant compounds in the four species belong to monoterpenes and, to a lesser degree, to sesquiterpenes, phenolic compounds and some alcohols (Table 1). Despite already having information on the composition of hydrolates of two species from South America (Rajeswara et al., 2006; Lima et al., 2009), the identification of the compounds in hydrolates of the four Tagetes species in Mexico constitutes another important step in advancing the phytochemical knowledge of the genus.
In vitro evaluation. The evaluated treatments displayed significant inhibiting effects on B. cinerea (p < 0.0001), F. oxysporum (p < 0.0053), P. capsici (p < 0.0001) and R. solani (p < 0.0001) (Table 2). The 100% T. parryi hydrolate inhibited the mycelial growth of B. cinerea by 71.3%, with no statistical difference with the effect produced by the commercial fungicide. Even dilutions of this hydrolate at 50 and 75% displayed statistical differences with the control, whereas with hydrolate at 100% or dilutions from the other Tagetes species, the inhibition of the mycelium was mostly lower than 40%, with no statistical difference with the control (Table 2). In P. capsici, the T. coronopifolia hydrolate at 75 and 100% effectively inhibited mycelial growth, similar to the fungicide. With T. minuta, T. parryi and T. terniflora hydrolates in 50 and 75% dilutions, P. capsici inhibition was significant (p < 0.0001) compared to the control, but not compared to the fungicide. No concentration of the evaluated hydrolates displayed a fungistatic effect against F. oxysporum and R. solani. The T. minuta, T. parryi and T. terniflora hydrolates inhibited these fungi by 26.6%. In the case of T. coronopifolia at 100%, F. oxysporum and R. solani were inhibited by 25 and 34.4%, respectively (Table 2). The inhibiting effect of the essential oils and hydrolates is due to the monoterpenes, sesquiterpenes and phenolic compounds (Hu et al., 2019; Hill, 2022). Monoterpenes are small and fit between the fatty molecules that make up the cell membrane and affect functions inside the cell, while sesquiterpenes are not small enough to fit through the cell membrane, but they have unique shapes that allow them to adhere to the spaces of three-dimensional protein structures and affect the activity of the protein (Hill, 2022). Hu et al. (2019) mention that the phenolic compounds can interfere with the membranes, the cell walls and enzyme action. In T. parryi hydrolate, a larger diversity of groups of compounds was found, including the phenolic compound 1,3-Di-terc-butiylbenzene (Table 1). In this regard, Zatla et al. (2017) mention that the phenolic compounds of Daucus carota subsp. sativus have antifungal activity against B. cinerea. Belabbés et al. (2017) attribute the antifungal effect against Penicillium expansum to the oxygenated sesquiterpenes found in the Calendula arvensis hydrolate. In T. parryi, T. coronopifolia and in T. minuta, sesquiterpene methyl 11-tetradecadianoate was found, with a relative abundance between 1.6 and 2.5% (Table 1) and the inhibiting effect of these hydrolates was greater (Table 2) to those reported for T. terniflora, which did not contain this compound. In addition, the oils with an abundance of monoterpenes inhibit the growth of fungi (Stević et al., 2014), which helps highlight that the analyzed Tagetes hydrolates contain abundant monoterpenes (Table 1). Although the antifungal effect is attributed to the most predominant compounds, it is the synergic effect of all the compounds that cause the antifungal effects, and also, some compounds are more active than others (Dhifi et al., 2016).
Percentage of <italic>in vitro</italic> inhibition of fungus mycelia after applying <italic>Tagetes</italic> species hydrolates.
Treatments
Inhibition (%) of fungal mycelia
B. cinerea
P. capsici
F. oxysporum
R. solani
TO
0 ± 0 e
0 ± 0 f
0± 0 c
0 ± 0 c
FC
100 ± 0 a
100 ± 0 a
100 ± 0 a
100 ± 0 a
H100C
40 ± 28.8 bcde
100 ± 0 a
25 ± 15.5 b
34.4 ± 22.2 b
H100M
35 ± 21.6 bcde
54.3 ± 2.5 b
21 ± 4.5 bc
20 ± 11.7 bc
H100P
71.3 ± 9.7 ab
55.3 ± 3 b
23 ± 4 b
26.6 ± 6.8 bc
H100T
25.3 ± 15 cde
57 ± 13.1 b
16.6 ± 2 bc
20 ± 2.6 bc
H75C
22.6 ± 23.5 cde
100 ± 0 a
16.6 ± 3.5 bc
32.6 ± 13.2 bc
H75M
34 ± 7.9 bcde
43.3 ± 9 bc
18.6 ± 7.6 bc
15.6 ± 6 bc
H75P
54.6 ± 18.9 bc
38.3 ± 10.4 bcd
12.3 ± 7 bc
17 ± 13.5 bc
H75T
14 ± 17.8 cde
38.3 ± 3 bcd
11.3 ± 10.5 bc
20 ± 11.5 bc
H50C
22.6 ± 2.3 cde
61.6 ± 20.4 b
9.1 ± 9.4 bc
19.6 ± 10.4 bc
H50M
25 ± 4.5 cde
27 ± 3.6 cde
16 ± 7.9 bc
10.6 ± 8.8 bc
H50P
54 ± 10.5 bcd
28.3 ± 8.5 cde
10.6 ± 6.5 bc
14.3 ± 7.5 bc
H50T
10.3 ± 24.2 de
17 ± 11.7 def
6.3 ± 7.57 bc
10 ± 12.6 bc
H25C
4.6 ± 5.6 e
10.3 ± 11.6 ef
1 ± 1 c
11.6 ± 18 bc
H25M
3.6 ± 6.3 e
16 ± 5 def
10.6 ± 7.5 bc
10 ± 10.7 bc
H25P
33.3 ± 7 bcde
13 ± 3 ef
9.3 ± 3 bc
13 ± 4.5 bc
H25T
0 ± 0 e
4.6 ± 8 ef
4 ± 4 bc
8.4 ± 0 bc
Valor p
0.0001
0.0001
0.0053
0.0001
CV
33
14
21
30
LSD
41
23
39
30
TO: Control, FC: Commercial fungicide, H: Hydrosol, 100, 75, 50 and 25: Concentration (%) of hydrosol used, C: T. coronopifolia, M: T. minuta, P: T. parryi, T: T. terniflora, CV: Coefficient of variation, LSD: Least significant difference, means with different letters between columns are statistically different (Tukey, 0.05). Average values ± standard deviation.
In vivo evaluation. The treatments with 100% hydrolates from the four Tagetes species displayed the greatest in vitro inhibition (Table 2). Therefore, they were picked up for their evaluation in vivo. The strawberry plants displayed no phytotoxic effects due to the application of Tagetes hydrolates, which gives good expectations for future evaluations in other plant species. The control plants inoculated with B. cinerea presented symptoms of the disease, both in fruits and flowers. On the other hand, the plants inoculated with F. oxysporum, P. capsici and R. solani displayed no symptoms of disease in flowers, yet they did in the perforated fruits (Figure 2). Strawberry fruits are highly perishable; in addition, if the fruit presents any mechanical damage or lesion, it facilitates infections by pathogens (Ángel-García et al., 2018). The lack of incidence of the disease in flowers may be related to the lack of lesions and to the fact that these fungi mainly affect roots, the crown and fruits (Koike and Gordon, 2015; Awad, 2016; Barboza et al., 2016).
The T. parryi hydrolate was effective as a preventive treatment against B. cinerea, since the perforated fruits (Figure 2A) and the flowers (Figure 2B) displayed no
Incidence of <italic>B. cinerea, R. solani, F. oxysporum</italic> and <italic>P. capsici</italic> in strawberry fruits (A) and flowers (B) three days after their inoculation in control (TO) plants and treated with 100% <italic>Tagetes coronopifolia</italic> (H100C), <italic>T. minuta</italic> (H100M), <italic>T. parryi</italic> (H100P) <italic>T. terniflora</italic> hydrolates (H100T).
incidence of the fungus. Therefore, this hydrolate represents an alternative input to chemical fungicides that have negative effects on the environment and have induced resistance in this fungus (Leroux, 2004). Zatla et al. (2017) evaluated the effect of the Daucus carota subsp. sativus hydrolate in strawberry fruit and it was effective as a preventive treatment, since it inhibited B. cinerea entirely until the fifth day. According to these authors, the effect was due to the abundant of phenolic compounds. Due to this, the effect observed with the T. parryi hydrolate can also be attributed to the phenolic compound 1,3-Di-terc-butylbenzene, along with the other more abundant monoterpenes and sesquiterpenes found in the hydrolate (Table 1). On the other hand, with the application of the T. terniflora hydrolate in the fruits (Figure 2A), no symptoms of the disease were observed, although the flowers were infected and with the T. minuta hydrolate, an opposite effect was observed (Figure 2B); this result shows that a joint application of these hydrolates may be effective against this fungus. The T. coronopifolia hydrolate did not work as a preventive treatment.
Conclusions
The hydrolates of the tested Tagetes species contain between 46 and 72% of monoterpenes, and to a lesser extent, some alcohols (0-33 %), sesquiterpenes (027%) and phenolic compounds (0-8 %). Although a fungistatic effect was observed in the evaluation in vitro with some hydrolates, this effect did not withstand in the in vivo application; only the application of the T. parryi hydrolate is effective as a preventive treatment against B. cinerea in strawberry plants during flowering and fruiting.