rmfi Revista mexicana de fitopatología Rev. mex. fitopatol 0185-3309 2007-8080 Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C. 10.18781/R. MEX.FIT.2024-03 Articles In vitro biological and chemical control of fungi associated with gummosis in citrus fruits in Yucatan, Mexico Hernández-Castillo Celida Aurora ¹ Rivas-Valencia Patricia ² Robles-Yerena Leticia ³ Sánchez-Alonso Mariana Guadalupe ⁴ Loeza-Kuk Emiliano ⁵ Departamento de Parasitología Agrícola, Universidad Autónoma Chapingo, Carretera México-Texcoco, km. 38.5. Texcoco, Edo. de México, México, CP 56230. Universidad Autónoma Chapingo Universidad Autónoma Chapingo Edo. de México 56230 Mexico Campo Experimental Valle de México, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Carretera Los Reyes-Texcoco, km. 13.5. Coatlinchán, Edo. de México, México, CP 56250. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Edo. de México 56250 Mexico Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria, Carretera Federal México-Pachuca, km. 37.5. Tecámac, Edo. de México, México, CP 55740. Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria, Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria Edo. de México 55740 Mexico Campo Experimental Valle de México, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Carretera Los Reyes-Texcoco, km. 13.5. Coatlinchán, Edo. de México, México, CP 56250. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Edo. de México 56250 Mexico Campo Experimental Mocochá, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, Carretera Mérida-Motul, km. 25. Mérida, Yucatán, México, CP 97454. Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Mérida Yucatán 97454 Mexico 05 11 2024 2024 42 4 RMEXFIT202403 31 05 2024 26 10 2024 This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License Abstract: Background/Objective.

In all citrus-producing regions in the world, gummosis is a disease that has caused losses in citrus production. This disease is caused by several pathogens. The objectives were to identify the fungi associated with gummosis in citrus orchards of Plan Chac, Sacalum, Yucatan; and to evaluate chemical and biological alternatives for the control of fungi associated with gummosis.

 Materials and Methods.

From fragments of plant tissue and soil, the associated fungi were isolated. The isolates were identified morphologically in plant tissue as Lasiodiplodia pseudotheobromae and in soil as Fusarium solani and Pestalotia spp. The pathogenicity test determined that L. pseudotheobromae is an agent associated with this disease. The isolates were subjected to in vitro tests with chemical fungicides and antagonist agents.

 Results.

Thiabendazole showed effectiveness for F. solani with an effective concentration to inhibit 50 % of the population (EC50) of 0.0612 mg L-1, with Pestalotia spp. inhibited growth at all concentrations evaluated and for L. pseudotheobromae, it showed an EC50 of 0.0049 mg L-1. In the case of Bacillus subtilis strain QST 713, the growth of F. solani (EC50 0.0496 mg L-1), Pestalotia spp. (EC50 0.0487 mg L-1) and L. pseudotheobromae (EC50 0.0528 mg L-1) decreased. On the other hand, Trichoderma harzianum showed a greater inhibition against F. solani, Pestalotia spp. and L. pseudotheobromae of 61.08, 62.93 and

35.64 %, respectively.

 Conclusion.

In the management of gummosis in citrus fruits, the use of biological agents such as Trichoderma and B. subtilis can be efficiently included, offering alternatives with less impact on the environment.

 Keywords: Trichoderma. Introduction:

Different phytopathogenic agents have been associated to the gummosis of citrus fruits. Species of the Phytophthora genus are the main ones that have been reported (Bright et al., 2004; Brentu and Vicent, 2015; Graham and Feichtenberger, 2015). However, the members of the Botryosphaeriaceae family have displayed certain relevance due to their capacity to adapt in order to infect other crops near the original native host fields (Mondragon-Flores et al., 2021).

Gummosis is distributed in all the citrus-producing areas of the world. It has caused losses in Italy (Aloi et al., 2021), Algeria (Linaldeddu et al., 2015; Berraf-Tebbal et al., 2020), Iran (Abdollahzadeh et al., 2010) and the United States (Adesemoye et al., 2014), and in Mexico, it is distributed in the areas that produce sweet citrus fruits and Mexican and Persian limes in the states of Colima (Rocha-Peña et al., 2003), Morelos (Valle-de la Paz et al., 2019a), Puebla, Veracruz (Bautista-Cruz et al., 2019), Nuevo León and Tamaulipas (Polanco et al., 2019), with important data that range between an incidence of 2 and 14% (Medina-Urrutia et al., 2002).

Symptoms were observed in necrotic lesions in stems and branches, along with the appearance of a gummy exudate, followed by wilting, the yellowing of leaves, defoliation and finally, the partial or complete death of the tree (Bautista-Cruz et al., 2019; Berraf-Tebbal et al., 2020; Aloi et al., 2021). The pathogen survives in the stubble of diseased plants, and is spread via trimming tools, but also via rainfall, irrigation, wind and insects (Moreira-Morillo et al., 2021). The disease prevails largely thanks to temperatures between 26 and 32 oC and a high relative humidity (80%) (Úrbez-Torres et al., 2010; Picos-Muñoz et al., 2015).

The control of gummosis has become more efficient with the use of preventive chemical fungicides such as Carbendazim (Da Silva Pereira et al., 2011; Valle-de la Paz et al., 2019b), Thiabendazole (Da Silva Pereira et al., 2011; Camacho-Tapia et al., 2021), Benomyl and copper-based compounds (Everett and Timudo-Torrevilla, 2007; Sáenz et al., 2019; Valle-de la Paz et al., 2019). Antagonistic microorganisms have also been used, such as Trichoderma spp. and Bacillus subtilis (Bhuvaneswari and Rao, 2001; Rusin et al., 2021). However, the use of chemical fungicides must be revised depending on the pathogen under study, as well as avoiding the generation of resistance. Obtaining biological alternatives for control is important for the conservation of biodiversity. This study has been developed with the goals of identifying the pathogens associated to gummosis in citrus fruit orchards in Plan Chac, Sacalum, Yucatan, as well as to evaluate the chemical and biological control alternatives that offer alternatives for the management of the disease.

 Materials and Methods

Plant material and isolation of fungi. Plant tissue (bark) and soil samples were used, taken from a semi-commercial orchard with orange (Citrus sinensis), lemon (C. latifolia) and grapefruit trees (C. paradisi) with symptoms of exudate and necrosis. The orchard is located in the town of Plan Chac, Sacalum, Yucatan. The samples were extracted in July and October, 2023. For the isolations of the tissue, 5 mm2 were cut, which were disinfected with 1 % sodium hypochlorite per minute and washed three times with sterile distilled water (Bautista-Cruz et al., 2019). The tissues were left to dry in sterile paper towels and then planted in dishes with natural PDA media (200 g potato, 20 g agar-agar, 15 g dextrose in 1000 mL of water) and incubated at 24 °C for 24 h.

Soil samples were taken around the trunks of trees with symptoms and at a depth of 30 cm. For the isolation of the soil fungi, the technique consisted in serial dilutions. Thus, in the first tube, 1 g of soil in 9 mL of sterile distilled water was added; later, 1 mL of that solution (soil-water) was transferred to a series of tubes with the same characteristics (Aziz and Zainol, 2018). Three dilutions were made of each sample (10-1 to 10-3). Out of the final solution, 20 µL were transferred into dishes with the natural PDA medium, which were incubated at 24 °C for 24 h and observed under the microscope to detect fungal growth.

Purifying and identifying isolates. The isolates were purified using hyphal tip, planted in a PDA medium (BD BIOXON®, Cuautitlán Izcalli, Mexico) and kept for a 7 to 14-day day period at 24 °C in an incubator (BINDER, Model BD53- UL, Tuttlingen, Germany). The morphological characterization of the purified isolations was carried out with the following culture media: PDA with antibiotics (39 g, 200 mg of streptomycin and 1000 mL of water) and Clover Leaf Agar (CLA) (20 g agar, 1000 mL water, five pieces of carnation leaf per dish). In the PDA medium, the pigmentation and growth rates of the cultures were determined. To study the morphology of the Fusarium genus, the CLA medium and moist chambers (Petri dish, wet paper and pieces of aluminum) which were evaluated after five days for the measurement of phyalids. In addition, macro and microconidia and chlamydospores were measured. For Pestalotia, conidia were measured, and for Lasiodiplodia, conidia, mature conidia and pycnidia were measured. After the incubation period, semipermanent glycerin preparations at 50% were prepared and examined with an optical microscope (Leica DM500, Heerbrugg, Germany) with a digital camera installed, with a 40x lens and the images were processed using the LAS EZ Software (version 3.4; Leica Microsystems, Germany).

Pathogenicity test. Based on the highest incidence found in the isolates, four C. sinensis plants were inoculated with L. pseudotheobromae in sour orange C. aurantium. The surface of the healthy plant tissue was disinfected with 70 % alcohol and a lesion was made in which a disk of active, 5-day old L. pseudotheobomae growth in PDA (5 mm) was placed (Bautista-Cruz et al., 2019; Berraf-Tebbal et al., 2020). The lesions were healed using wet cotton and Parafilm paper (Bemis, U.S.A.). The control plants received a sterile PDA disk. The plants were evaluated under microtunnel conditions for 21 days, with a mean temperature of 24 °C (max. 47 °C, man. 11 °C) and a relative humidity of 97 % (max. 100 %, min. 85 %). Once the period is finished, the presence of signs and symptoms of gummosis was found. The leaves and stems with lesions were used, and the fungi were reisolated in PDA medium. When the culture was developed, the morphological and cultural characterization was carried out to confirm the presence of structures that coincide with the original isolation.

In vitro evaluation of chemical fungicides and antagonists. The technique consisted in the planting of the isolates in a PDA medium with fungicides at different concentrations (Dhingra and Sinclair, 1995). A 5 mm inoculant dick was extracted from the edge of the pure culture of the fungus in question. Four chemical fungicides were evaluated (Benomyl, Mancozeb, Carbendazim, Thiabendazole) and a biological product based on B. subtilis, strain QST 713. For the three isolations, seven concentrations were used with three repetitions, including the control (Table 1). The concentrations were calculated according to the volume of PDA medium and active ingredient. They were incubated at a temperature of 24°C. The inhibition percentages of the mycelial growth (IPMG) and the effective concentration (EC) were obtained. Once the mycelial growth of the control occupied the total area of the Petri dish, the growth percentage of each one of the treatments, was calculated using the formula by Arce-Araya et al., (2019): % fungal growth = [(Fungi diameter in PDA without fungicide - Fungi diameter in PDA with fungicide) / (Fungi diameter in PDA without fungicide) * 100]. The EC that inhibits 50 % of the mycelial growth (EC50) was calculated using the GraphPad Prism Software (version 8.0.1; GraphPad, San Diego, CA).

Treatments evaluated for the control of phytopathogenic fungi associated to the gummosis of citrus fruits in Plan Chac, Sacalum, Yucatan.
Fungus Brand Active ingredient (a.i.) Concentrations evaluated (mg/L)
Fusarium solani Carbendazim Carbendazim a 500 g 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0
Tecto Thiabendazole a 600 g 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0
Benomilo Benomyl a 500 g 0, 0.01, 1.0, 5.0, 10, 50, 100
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0
Pestalotia spp. Benomilo Benomyl a 500 g 0, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100
Mancozeb Mancozeb a 800 g 0, 0.1, 1, 10, 50, 100, 500
Tecto Thiabendazole a 600g 0, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0
Lasiodiplodia pseudotheobromae Mancozeb Mancozeb a 800 g 0, 0.1, 1.0, 10, 50, 100, 500
Benomilo Benomyl a 500 g 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10
Tecto Thiabendazole a 600 g 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0

Dual in vitro Trichoderma test. In order to evaluate the antagonistic ability of Trichoderma, the dual culture technique, described by Morton and Stroube (1955), was used. The test was carried out with the phytopathogenic agents obtained, and with two antagonistic agents: Trichoderma harzianum and T. viride, which belong to the INIFAP collection. The test consisted in placing a mycelium disk of each fungus (5 mm) on an edge of the Petri dish and on the opposite edge, a disk of the antagonistic agent (5 mm) was placed, with a separation of 2 cm. For each treatment, three repetitions and one control were included. They were kept at a temperature of 24 °C. Upon the termination of the period, the % of radial inhibition (PRI) was calculated using the formula by Osorio et al. (2016): PRI= [(Fungi diameter without Trichoderma-Fungi diameter with Trichoderma) / (Fungi diameter without Trichoderma) * 100].

Statistical analysis. The experimental design used was completely randomized. An analysis of variance was carried out along with a comparison of means using Tukey’s test (P ≤ 0.05). The results were analyzed using the SAS statistical software (version 9.0; SAS Institute, Cary, N.C.).

 Results and Discussion

Morphological characterization of fungus associated with gummosis. Cultures were obtained from the plant samples that correspond to only one fungus with the following characteristics: A whit, circular growth and a filamentous edge with a spongy texture that turned military green and finally black (Figure 1a). Picnidia, 133 µm wide x 212.69 µm long appeared, with conidia that measured (17.75-) 25.30

Front and back of isolates in PDA culture medium of fungi related to the gummosis of citrus fruits. <bold>A)</bold> Six-day old <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> culture, obtained from tissue from the cortex. <bold>B)</bold> Six-day old <italic>Fusarium solani</italic> culture. <bold>C)</bold> Six-day old <italic>Pestalotia</italic> spp<italic>.</italic> culture, both obtained from the soil. (-34.97) µm long x (11.37-) 13.30 (-18.08) µm wide, sub-ovoidal to ellipsoidal in shape, with a truncated apex and base (<xref ref-type="fig" rid="f2">Figure 2</xref>).

The conidia are initially hyaline and aspetated, and then brown and septated with a longitudinal striated. In addition, other structures such as conidiogenous cells and paraphyses appeared. These characteristics correspond to those described by Phillips et al. (2013) and Liang et al. (2020) for L. pseudotheobromae.

Microscopic morphology of fruiting <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> bodies<italic>.</italic> <bold>A, B</bold> and <bold>C)</bold> Globose pycnidial conidiomata, <bold>D)</bold> mature septate conidia with longitudinal striations, <bold>E)</bold> conidiogenous cells and paraphyses and <bold>F)</bold> immature aseptate conidia.

From the soil samples, cultures were obtained with a circular, cream-colored growth, filamentous edge and flat texture that turned light brown (Figure 1b). The slightly curved, triseptate macroconidia that measured (28.99-) 35.02 (-42.76) µm in length by (4.18-) 5.18 (-6.99) µm in width. The microconidia with or without a septum, (6.86-) 10.02 (-14.08) µm in length by (5.24-) 3.75 (-2.41) µm in width. The long and cylindrical phialides measuring 97.30 µm, and double-wall chlamidospores, terminal or intercalary measuring 8.69 µm in diameter (Figure 3). The above description coincides with F. solani (Leslie and Summerell, 2006). In addition, a third, white culture with circular rings was formed, cottonlike in texture

Microscopic morphology of <italic>Fusarium solani</italic> associated to the gummosis in citrus fruits<italic>.</italic>

A) Phialides and conidia grouped into flower heads, B) Mature septated conidia, C) Mature microconidia. and filamentous edges (Figure 1c). Presence of acervuli measuring 506 µm and curved conidia measuring (13.19-) 21.61 (-28.07) µm in length (5.93-) 8.01 (-9.97) µm in width, with five cells of hyaline ends (terminal and apical). The terminal end presented three appendages that measured 4.96-30.3 µm, 5.33-31.06 µm and 5.28-29.81 µm. On the other hand, the apical end of just one short, 2.86-7.83 µm long appendage. This description coincides with the Pestalotia genus, with no possible distinction of a species, according to Guba (1961) and Barnett and Hunter (1998).

Isolate pathogenicity test. On day 21, necrotized lesions were observed with amber-colored exudates in stems, as well as the presence of pycnidia in stems and leaves (Figure 4). Similar to findings by Bautista-Cruz et al. (2019) and Berraf- Tebbal et al. (2020). The causal agent of the gummosis disease was confirmed to correspond to L. pseudotheobromae, using Koch’s postulates.

Effectiveness of fungicides. Our results helped identify the fungicide with the highest effectiveness in the reduction of the mycelial growth of F. solani, Pestalotia spp. and L. pseudotheobromae. For F. solani, the analysis of variance displayed significant differences between Carbendazim, Thiabendazole and Serenade (P ≤ 0.05). The Thiabendazole was the most effective chamical fungicide, since minimum doses were able to inhibit F. solani (Table 2, Figure 5). The benzimidazoles such as Carbendazim and Thiabendazole have been effective to control the Fusarium genus (Agrios, 2005). Zárate-Ramos et al. (2022) determined that Thiabendazole

Symptoms and signs caused by <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> on citrus fruits, A) stem necrosis, B) presence of pycnidia on stems, and C) production of exudate or gum.

Mean effective concentration (EC ) (mg L<sup>-1</sup>) of each fungicide tested <italic>in vitro</italic> for the inhibition of the mycelial growth of <italic>Fusarium solani</italic> obtained from citrus orchards in Plan Chac, Sacalum, Mexico.
Fungicides Mean EC50 Optimal value EC50 Confidence interval at 95%
Benomyl 0.4807az 0.4150 0.2687 a 0.6068
Carbendazim 0.4274ab 0.4243 0.3477 a 0.5037
Thiabendazole 0.0612b 0.0610 0.05179 a **
Serenade 0.04970b 0.0496 0.04613 a 0.05303

Means with the same letter in the column are statistically equal, according to Tukey’s test (P ≤ 0.05). NA= Not applicable. ** = Undefined. Value of P = 0.0121.

was effective with an EC50 of 14.50 mg L-1 against F. incarnatum, while Medina- Osti et al. (2022) reported that Thiabendazole was effective at an EC50 of 7.2 mg L-1 against F. sacchari. In addition, the, biological product Serenade was effective (Table 2, Figure 5). The bacteria of the Bacillus genus have been reported to produce antimicrobial compounds against Fusarium (Mardanova et al., 2017). In the scae of F. solani, to inhibit more than 50 % of the fungus, a concentration of 0.0497 mg L-1 was needed (Table 2). Carbendazim proved to be efficient to inhibit

<italic>In vitro</italic> effect of fungicides against fungi associated to the gummosis of citrus fruits in five days. Growth of <italic>Fusarium solani</italic>: <bold>A)</bold> Medium with Thiabendazole at 0.5 mg L<sup>-1</sup>. <bold>B)</bold> Medium with Carbendazim at 0.8 mg L<sup>-1</sup>. <bold>C)</bold> Medium with Benomyl at 50 mg L<sup>-1</sup>. <bold>D)</bold> Control. Growth of <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic>: <bold>E)</bold> Medium with Thiabendazole at 0.01 mg L<sup>-1</sup>. <bold>F)</bold> Medium with Benomyl at 0.1 mg L<sup>-1</sup>. <bold>G)</bold> Medium with Mancozeb at 50 mg L<sup>-1</sup> <bold>H)</bold> Control. Growth of <italic>Pestalotia</italic> spp.: <bold>I)</bold> Medium with Thiabendazole at 0.01 mg L<sup>-1</sup>. <bold>J)</bold> Medium with Benomyl al 1 mg L<sup>-1</sup>. <bold>K)</bold> Medium with Mancozeb at 100 mg L<sup>-1</sup>. <bold>L)</bold> Control.

its mycelial growth (Table 2, Figure 5). In general, Carbendazim has displayed good results against F. oxysporum in tomato (Jahanshir and Dzhalilov, 2010) and against F. solani in chili pepper (Madhavi and Bhattiprolu, 2011). González-Oviedo et al. (2022) reported that strains of F. oxysporum, from vanilla, were sensitive to Benomyl and Carbendazim. However, Benomyl was less effective, since the highest percentage of inhibition was displayed at high elevations (Table 2, Figure 5). Applying Benomyl on the soil restricted the colonization of F. oxysporum in melon (Maraite and Meyer, 1971). Benomyl has been shown to reduce the germination rate of the Fusarium conidia (Decallonne and Meyer, 1972). Romero- Velázquez et al. (2015) determined that an EC50 of 0.01 mg L-1 was presented by B. subtilis against Fusarium in chayote. On the other hand, Zarate-Ramos et al. (2022) indicated that B. subtilis was efficient with an EC50 0.00014 mg L-1, and completely inhibited Fusarium at 0.01, 0.05 and 1 mg L-1, On the other hand, the analysis of variance (P ≤ 0.05) for Pestalotia spp. proved that there are significant differences between Benomyl and Mancozeb. Thiabendazole proved to be the most efficient in all the concentrations evaluated (Table 3). Hernández-Ceja et al. (2021) reported that Thiabendazole, starting at 5 mg mL-1 inhibited 100% of the fungi associated with the regressive death of the cranberry: Pestalotiopsis clavispora, Colletotrichum gloeosporioides and L. pseudotheobromae. With Serenade, an optimum value was obtained of EC50 0.04870 mg L-1. Monroy and Lizarazo (2010) found no antagonistic properties against Pestalotia spp., with the cultivation of the fungus with Pseudomonas fluorescens and B. subtilis bacteria at a concentration of 106 UFC/mL8 in PDA. Mancozeb was the least effective (Table 3). The 100 % inhibition of the fungus was achieved with the use of the highest dose evaluated. In strawberry, Ara et al. (2017) and Rajnish & Gauta, (2022) managed to completely inhibit Pestalotia spp. at concentrations of 250, 500 and 1000 mg L-1. On the other hand, Carbendazim and Mancozeb were the ones to control P. anacardii in mango (Patil et al., 2019).

Mean effective concentration (EC ) (mg L<sup>-1</sup>) of each fungicide tested <italic>in vitro</italic> for the inhibition of the mycelial growth of <italic>Pestalotia</italic> spp. obtained from citrus orchards in Plan Chac, Sacalum, Yucatan.
Fungicides Mean EC50 Optimal value EC50 Confidence interval at 95%
Mancozeb 58.73az 58.09 45.44 a 73.40
Benomyl 0.0819b 0.06934 0.03579 a **
Serenade 0.0481b 0.04870 0.04547 a 0.05117
Thiabendazole NA NA NA

Means with the same letter in the column are statistically equal, according to Tukey’s test (P ≤ 0.05). NA= Not applicable. ** = Undefined. Value of P = 0.0001.

In L. pseudotheobromae, the analysis of variance indicates that there were no significant differences on the EC50 between Benomyl, Serenade and Thiabendazole, although they do differ statistically with Mancozeb (P ≤ 0.05). Thiabendazole was effective, since it displayed a lower value for EC50 (Table 4, Figure 5) and it displayed a greater inhibition, starting at 0.01 mg×L-1 (98.55%). Benzimidazoles have been effective against L. theobromae. Out of 120 L. theobromae isolates, 91.6% were reported to be sensitive to benzimidazoles with EC50 values ranging from 0.36 to 1.27 µg mL-1 for Thiabendazole (Da Silva et al., 2012). Under field conditions, Camacho-Tapia et al. (2021) showed that the use of Thiabendazole provided good control over gummosis in lemon trees. Control with Benomyl was

Mean effective concentration (EC ) (mg L<sup>-1</sup>) of each fungicide tested <italic>in vitro</italic> for the inhibition of the mycelial growth of <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> obtained from citrus orchards in Plan Chac, Sacalum, Yucatan.
Fungicides Mean EC50 Optimal value EC50 Confidence interval at 95%
Mancozeb 58.73az 58.09 45.44 a 73.40
Benomyl 0.0819b 0.06934 0.03579 a **
Serenade 0.0481b 0.04870 0.04547 a 0.05117
Thiabendazole NA NA NA

zMeans with the same letter in the column are statistically equal, according to Tukey’s test (P ≤ 0.05). ** = Undefined (GraphPad Prism does not show a complete trust interval). Value of P = 0.0004. achieved at low concentrations (Table 4, Figure 5); of Lasiodiplodia was achieved with an application of 0.1 mg L-1 (86.58 %) and complete inhibition, at 10 mg×L-1 (99.56 %). This is similar to results by Da Silva Pereira et al. (2021), in which the EC of Benomyl for L. theobromae was between 0.002 and 1.75 µg mL-1. In addition, some species of Botryosphaeriaceae were controlled with Benomyl (EC ranging from 0.36 to 0.55 µg mL-1) (Bester et al., 2007). The application of Benomyl and copper oxychloride-based compounds against L. theobromae is effective in different phenological stages of the crop (Sáenz et al., 2019). Serenade was the least effective, with an EC value of 0.0528 mg L-1. Mancozeb managed to control L. pseudotheobromae at high concentrations of 50, 100, 500 mg L-1, compared to the evaluated fungicides. This was confirmed by Dianda et al. (2020) and Sultana and Ghaffar (2010), since Lasiodiplodia was completely inhibited at 100 and 500 mg L-1. Mancozeb, along with Carbendazim, has allowed for broader control (Jadeja and Bhatt, 2010; Valle- de la Paz et al., 2019b). On the other hand, Sultana and Ghaffar (2010) obtained good results with the application of B. subtilis in pre- and post-emergence control of L. theobromae.

Effect of Trichoderma. Both T. harzianum and T. viride inhibited the development of fungi related to the gummosis of citrus fruits; however, according to the ANOVA, T. harzianum caused the greatest inhibition. Its effectiveness as a biological agent control against fungi, nematodes and insects has been reported (Ferreira and Musumeci, 2021). In F. solani, the ANOVA indicates that T. harzianum (61.08%) displayed significant differences in comparison with T. viride (22.17%) (P ≤ 0.05) (Table 5, Figure 6). Likewise, Fernández and Suárez (2009) reported that applying T. harzianum inhibited over 50 % of Fusarium in passionfruit. In eggplants, Ganesh and Dwivedi (2019) reported that around 20 % of Fusarium was inhibited

Percentage of mycelial growth inhibition by the effect of <italic>Trichoderma</italic> against <italic>F. solani</italic>, <italic>Pestalotia</italic> spp. and <italic>L. pseudotheobromae</italic>.
Pathogen Treatments Mean
Fusarium solani T. harzianum 61.08az
T. viride 22.17b
P value 0.0001
DMS 5.549
Pestalotia spp. T. harzianum 62.93az
T. viride 53.78a
P value 0.0001
DMS 14.76
Lasiodiplodia pseudotheobromae T. harzianum 35.64az
T. viride 25.45a
P value 0.0001
DMS 4.856

zMeans with the same letter in the column do not differ statistically according to Tukey’s test (P ≤ 0.05). LSD; Least significant difference. with T. viride. Madhavi and Bhattiprolu (2011) indicate that the integration of different treatments such as soaking seedlings with Carbendazim, the addition of vermicompost, soaking with fungicide and the application of T. viride is efficient for the control of the wilting disease by Fusarium in chili pepper. For Pestalotia, the analysis of variance (P ≤ 0.05) indicates that T. harzianum (62.93%) displayed significant differences in comparison with T. viride (53.78%) (Table 5, Figure 6). In mango, the fungus was inhibited with the application of Trichoderma (72.88%) (Bhuvaneswari and Rao, 2001). In the case of Lasiodiplodia, the ANOVA (P < 0.05) indicates that T. harzianum (35.64%) did not display significant differences in comparison with T. viride (25.45%) (Table 5, Figure 6). Boat et al. (2022) determined that T. harzianum reduced L. theobromae by 64.1%, whereas Bhuvaneswari and Rao (2001) reported that 62.41% of the fungal mycelial growth was reduced. Likewise, Da Silva et al. (2022) showed that Trichoderma reduced the growth of F. solani (34%) and L. theobromae (89%) related to Nopalea cochinillifera. In Morelos, L. citricola was found to be sensitive to the evaluated doses of T. harzianum (0.55, 0.39 and 0.19 g/100 mL) (Valle-de la Paz, 2019a).

Effect of <italic>Trichoderma</italic> spp. In the development of fungi associated to the gummosis of citrus fruits. <bold>A)</bold> <italic>Fusarium solani vs T. harzianum.</italic> <bold>B)</bold> <italic>F. solani</italic> vs <italic>T. viride.</italic> <bold>C)</bold> <italic>Pestalotia</italic> spp vs <italic>T. harzianum</italic>. <bold>D)</bold> <italic>Pestalotia</italic> vs <italic>T. viride.</italic> <bold>E)</bold> <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> vs <italic>T. harzianum.</italic> <bold>F)</bold> <italic>L. pseudotheobromae</italic> vs <italic>T. viride</italic>.

Conclusions

The morphological identification and pathogenicity tests showed that the disease of gummosis in citrus fruits from the town of Plan Chac in Sacalum, Yucatan, is caused by L. pseudotheobromae. In addition, other phytopathogenic fungi were identified: Pestalotia spp. and F. solani. The treatment with Thiabendazole, B. subtilis strain QST 713 and T. harzianum control F. solani, L. pseudotheobromae and Pestalotia spp. efficiently. The management of gummosis fruits can be carried out in combination with the use of biological agents, thus reducing the use of chemical control and avoiding a possible long resistance with its long-term use.

 Literatura citada Abdollahzadeh, J Javadi, A Goltapeh, EM Zare, R Phillips, AJL (2010). Phylogeny and morphology of four new species ofLasiodiplodiafrom Iran. Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 25(2):1-10. 10.3767/003158510X524150. Abdollahzadeh J Javadi A Goltapeh EM Zare R Phillips AJL 2010 Phylogeny and morphology of four new species of Lasiodiplodia from Iran Persoonia - Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi 10.3767/003158510X524150 Adesemoye, AO Mayorquin, JS Wang, DH Twizeyimana, M Lynch, SC Eskalen, A (2014). Identification of species ofBotryosphaeriaceaecausing Bot Gummosis in Citrus in California. Plant Disease 98(1):55-61. 10.1094/pdis-05-13-0492-re. Adesemoye AO Mayorquin JS Wang DH Twizeyimana M Lynch SC Eskalen A 2014 Identification of species of Botryosphaeriaceae causing Bot Gummosis in Citrus in California Plant Disease 10.1094/pdis-05-13-0492-re Agrios, GN (2005). Plant Pathology. Fifth Edition. Academic Press. New York, USA. 922p. Agrios GN 2005 Plant Pathology Fifth Edition Academic Press New York, USA 922p Aloi, F Riolo, M Parlascino, R Pane, A Cacciola, SO (2021). Bot gummosis of lemon (Citrus × limon) caused byNeofusicoccum parvum. Journal of Fungi 7(4):294. 10.3390/jof7040294. Aloi F Riolo M Parlascino R Pane A Cacciola SO 2021 Bot gummosis of lemon (Citrus × limon) caused by Neofusicoccum parvum Journal of Fungi 10.3390/jof7040294 Ara, MT Monzur, S Saand, MA Islam, R Alam, S Hossain, M (2017). The first report ofPestalotiopsissp. causing crown rot disease on strawberry (Fragaria×ananassaDuch.) in Bangladesh and evaluation of fungicide activity. International Journal of Biosciences 11(4):305-358. Ara MT Monzur S Saand MA Islam R Alam S Hossain M 2017 The first report of Pestalotiopsis sp. causing crown rot disease on strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) in Bangladesh and evaluation of fungicide activity International Journal of Biosciences Arce-Araya, C Varela-Benavides, I Torres-Portuguez, S (2019). Inhibición del crecimiento micelial de hongos asociados a antracnosis en ñame (Dioscorea alata). Agronomía Mesoamericana 30(2):381-393. 10.15517/am.v30i2.32653. Arce-Araya C Varela-Benavides I Torres-Portuguez S 2019 Inhibición del crecimiento micelial de hongos asociados a antracnosis en ñame (Dioscorea alata) Agronomía Mesoamericana 10.15517/am.v30i2.32653 Aziz, NH Zainol, N (2018). Isolation and identification of soil fungi isolates from forest soil for flooded soil recovery. IOP Conference Series: Materials Science and Engineering 342:012028. 10.1088/1757-899X/342/1/012028. Aziz NH Zainol N 2018 Isolation and identification of soil fungi isolates from forest soil for flooded soil recovery IOP Conference Series: Materials Science and Engineering 10.1088/1757-899X/342/1/012028 Barnett, HL Hunter, BB (1998). Illustrated Genera of Imperfect Fungi. Fourth Edition. American Phytopathological Society Press. St. Paul, Minnesota, USA. 218p. Barnett HL Hunter BB 1998 Illustrated Genera of Imperfect Fungi Fourth Edition American Phytopathological Society Press St. Paul, Minnesota, USA 218p Bautista-Cruz, MA Almaguer-Vargas, G Leyva-Mir, SG Colinas-León, MT Correia, KC Camacho-Tapia, M Robles-Yerena, L Michereff, SJ Tovar-Pedraza, JM (2019). Phylogeny, distribution, and pathogenicity ofLasiodiplodiaspecies associated with cankers and dieback symptoms of Persian lime in Mexico. Plant Disease 103(6):1156-1165. 10.1094/PDIS-06-18-1036-RE. Bautista-Cruz MA Almaguer-Vargas G Leyva-Mir SG Colinas-León MT Correia KC Camacho-Tapia M Robles-Yerena L Michereff SJ Tovar-Pedraza JM 2019 Phylogeny, distribution, and pathogenicity of Lasiodiplodia species associated with cankers and dieback symptoms of Persian lime in Mexico Plant Disease 10.1094/PDIS-06-18-1036-RE Berraf-Tebbal, A Mahamedi, AE Aigoun-Mouhous, W Špetík, M Čechová, J Pokluda, R Baránek, M Eichmeier, A Alves, A (2020). Lasiodiplodia mitidjanasp. nov. and otherBotryosphaeriaceaespecies causing branch canker and dieback ofCitrus sinensisin Algeria. PloS One 15(5):e0232448. 10.1371/journal.pone.0232448. Berraf-Tebbal A Mahamedi AE Aigoun-Mouhous W Špetík M Čechová J Pokluda R Baránek M Eichmeier A Alves A 2020 Lasiodiplodia mitidjana sp. nov. and other Botryosphaeriaceae species causing branch canker and dieback of Citrus sinensis in Algeria PloS One 10.1371/journal.pone.0232448 Bester, W Crous, PW Fourie, PH (2007). Evaluation of fungicides as potential grapevine pruning wound protectants againstBotryosphaeriaspecies. Australasian Plant Pathology 36(1):73-77. 10.1071/AP06086. Bester W Crous PW Fourie PH 2007 Evaluation of fungicides as potential grapevine pruning wound protectants against Botryosphaeria species Australasian Plant Pathology 10.1071/AP06086 Bhuvaneswari, V Rao, MS (2001). Evaluation ofTrichoderma virideantagonistic to postharvest pathogens on mango. Indian Phytopathology 54(4):493-494. https://www.phtnet.org/research/view-abstract.asp?research_id=wr075. Bhuvaneswari V Rao MS 2001 Evaluation of Trichoderma viride antagonistic to postharvest pathogens on mango Indian Phytopathology https://www.phtnet.org/research/view-abstract.asp?research_id=wr075 Boat, BMA Taïeb, N Agriopoulou, S Miché, L Moussango, D Sameza, ML Dupuy, N Roussos, S Boyom, FF (2022). Identification of native soil-derivedTrichodermaspp. isolates and analysis of their antagonist traits againstLasiodiplodia theobromaecausing stem-end rot in papaya. Archives of Phytopathology and Plant Protection 55(15):1766-1794. 10.1080/03235408.2022.2116689. Boat BMA Taïeb N Agriopoulou S Miché L Moussango D Sameza ML Dupuy N Roussos S Boyom FF 2022 Identification of native soil-derived Trichoderma spp. isolates and analysis of their antagonist traits against Lasiodiplodia theobromae causing stem-end rot in papaya Archives of Phytopathology and Plant Protection 10.1080/03235408.2022.2116689 Brentu, FC Vicent, A (2015). Gummosis of citrus in Ghana caused byPhytophthora citrophthora. Australasian Plant Disease Notes 10(34):1-3. 10.1007/s13314-015-0184-z. Brentu FC Vicent A 2015 Gummosis of citrus in Ghana caused by Phytophthora citrophthora Australasian Plant Disease Notes 10.1007/s13314-015-0184-z Bright, DB Irey, MS Baucum, LE Graham, JH (2004). Soil, rootstock and climatic factors affect populations ofPhytophthora nicotianaein south Florida citrus plantings. Proceedings of Florida State Horticultural Society 117:1487-151. Bright DB Irey MS Baucum LE Graham JH 2004 Soil, rootstock and climatic factors affect populations of Phytophthora nicotianae in south Florida citrus plantings Proceedings of Florida State Horticultural Society Camacho-Tapia, M Leyva-Mir, SG Bautista-Cruz, MA Vargas, GA León, MTC Pedraza, JMT (2021). Efectividad de fungicidas yTrichodermaspp. para el control deLasiodiplodiaspp. en huertos de limón ‘Persa’ en Veracruz. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 12(2):345-353. 10.29312/remexca.v12i2.2551. Camacho-Tapia M Leyva-Mir SG Bautista-Cruz MA Vargas GA León MTC Pedraza JMT 2021 Efectividad de fungicidas y Trichoderma spp. para el control de Lasiodiplodia spp. en huertos de limón ‘Persa’ en Veracruz Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 10.29312/remexca.v12i2.2551 Da Silva, PAV Martins, RB Michereff, SJ Da Silva, MB Saraiva, CMP (2012). Sensitivity ofLasiodiplodia theobromaefrom Brazilian papaya orchards to MBC and DMI fungicides. European Journal of Plant Pathology 132:489-498. 10.1007/s10658-011-9891-2. Da Silva PAV Martins RB Michereff SJ Da Silva MB Saraiva CMP 2012 Sensitivity of Lasiodiplodia theobromae from Brazilian papaya orchards to MBC and DMI fungicides European Journal of Plant Pathology 10.1007/s10658-011-9891-2 Da Silva, BF Da Costa, DP Fragoso, SCA Da Rocha, GFADT Lima, LICH Pereira, GE Valente, ME (2022). Selection and control efficacy ofTrichodermaspp. againstFusarium solaniandLasiodiplodia theobromaecausing root rot in forage cactus. Physiological and Molecular Plant Pathology 122:101900. Da Silva BF Da Costa DP Fragoso SCA Da Rocha GFADT Lima LICH Pereira GE Valente ME 2022 Selection and control efficacy of Trichoderma spp. against Fusarium solani and Lasiodiplodia theobromae causing root rot in forage cactus Physiological and Molecular Plant Pathology Das, CM Mahanta, IC (1985). Evaluation of some fungicides againstPestalotia palmarumCke., incitant of grey blight of coconut. Pesticides 19:37-38. Das CM Mahanta IC 1985 Evaluation of some fungicides against Pestalotia palmarum Cke., incitant of grey blight of coconut Pesticides Decallonne, JR Meyer, JA (1972). Effect of benomyl on spores ofFusarium oxysporum. Phytochemistry 11(7):2155-2160. 10.1016/S0031-9422(00)88370-3. Decallonne JR Meyer JA 1972 Effect of benomyl on spores of Fusarium oxysporum Phytochemistry 10.1016/S0031-9422(00)88370-3 Dhingra, OD Sinclair, JB (1995). Basic Plant Pathology Methods. Second Edition. CRC Press. Boca Raton, USA. 429p.. Dhingra OD Sinclair JB 1995 Basic Plant Pathology Methods Second Edition. CRC Press. Boca Raton, USA. 429p. Dianda, OZ Wonni, I Diana, F Traoré, O Tinlé, Z Borro, F (2020). In vitroefficacy of some plant aqueous extracts against two species ofLasiodiplodiaassociated to mango decline in Burkina Faso. International Journal of Biological and Chemical Sciences 14(8):2699-2712. 10.4314/ijbcs.v14i8.4. Dianda OZ Wonni I Diana F Traoré O Tinlé Z Borro F 2020 In vitro efficacy of some plant aqueous extracts against two species of Lasiodiplodia associated to mango decline in Burkina Faso International Journal of Biological and Chemical Sciences 10.4314/ijbcs.v14i8.4 Esiegbuya, OD Oruade-Dimaro, EA Odigie, EE Okungbowa, FI Igbinedion, O Ojieabu, A (2014). In vitroEvaluation of some selected fungicides againstPestalotiopsis clavisporaandPseudocochliobolus eragrostidisisolated fromVitellaria paradoxaseedlings. Journal of Agriculture and Veterinary Science 7(1):80-85. 10.9790/2380-07118085. Esiegbuya OD Oruade-Dimaro EA Odigie EE Okungbowa FI Igbinedion O Ojieabu A 2014 In vitro Evaluation of some selected fungicides against Pestalotiopsis clavispora and Pseudocochliobolus eragrostidis isolated from Vitellaria paradoxa seedlings Journal of Agriculture and Veterinary Science 10.9790/2380-07118085 Everett, KR Timudo-Torrevilla, OE (2007). In vitrofungicide testing for control of avocado fruit rots. New Zealand Plant Protection 60:99-103. 10.30843/nzpp.2007.60.4632. Everett KR Timudo-Torrevilla OE 2007 In vitro fungicide testing for control of avocado fruit rots New Zealand Plant Protection 10.30843/nzpp.2007.60.4632 Fernández, BRJ Suárez, MCL (2009). Antagonismoin vitrodeTrichoderma harzianumRifai sobreFusarium oxysporumSchlecht f. sp.passifloraeen maracuyá (Passiflora edulis sims var. flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana. Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín 62(1):4743-4748. http://www.scielo.org.co/pdf/rfnam/v62n1/a01v62n1.pdf. Fernández BRJ Suárez MCL 2009 Antagonismo in vitro de Trichoderma harzianum Rifai sobre Fusarium oxysporum Schlecht f. sp. passiflorae en maracuyá (Passiflora edulis sims var. flavicarpa) del municipio zona bananera colombiana Revista Facultad Nacional de Agronomía Medellín http://www.scielo.org.co/pdf/rfnam/v62n1/a01v62n1.pdf Ferreira, FV Musumeci, MA (2021). Trichodermaas biological control agent: scope and prospects to improve efficacy. World Journal of Microbiology and Biotechnology 37(90):1-17. 10.1007/s11274-021-03058-7. Ferreira FV Musumeci MA 2021 Trichoderma as biological control agent: scope and prospects to improve efficacy World Journal of Microbiology and Biotechnology 10.1007/s11274-021-03058-7 Ganesh, P Dwivedi, SK (2019). Biological and Chemical Management ofFusarium solaniCausing Wilt in Eggplants. International Journal of Scientific Research and Reviews 7(4):1914-1925. https://www.researchgate.net/publication/336209429_Biological_and_Chemical_Management_of_Fusarium_solani_Causing_Wilt_in_Eggplants. Ganesh P Dwivedi SK 2019 Biological and Chemical Management of Fusarium solani Causing Wilt in Eggplants International Journal of Scientific Research and Reviews https://www.researchgate.net/publication/336209429_Biological_and_Chemical_Management_of_Fusarium_solani_Causing_Wilt_in_Eggplants González-Oviedo, NA Iglesias-Andreu, LG Flores-de la Rosa, FR Rivera-Fernández, A Luna-Rodríguez, M (2022). Genetic analysis of the fungicide resistance inFusarium oxysporumassociated toVanilla planifolia. Revista Mexicana de Fitopatología 40(3):330-348. 10.18781/r.mex.fit.2203-3. González-Oviedo NA Iglesias-Andreu LG Flores-de la Rosa FR Rivera-Fernández A Luna-Rodríguez M 2022 Genetic analysis of the fungicide resistance in Fusarium oxysporum associated to Vanilla planifolia Revista Mexicana de Fitopatología 10.18781/r.mex.fit.2203-3 Graham, J Feichtenberger, E (2015). CitrusPhytophthoradiseases: management challenges and successes. Journal of Citrus Pathology 2(1):1-11. 10.5070/C421027203. Graham J Feichtenberger E 2015 Citrus Phytophthora diseases: management challenges and successes Journal of Citrus Pathology 10.5070/C421027203 Guba, EF (1961). Monograph ofMonochaetiaandPestalotia. Harvard University Press. Cambridge, MA, USA. 342p.. Guba EF 1961 Monograph of Monochaetia and Pestalotia Harvard University Press. Cambridge, MA, USA. 342p. Hernández-Ceja, A Loeza-Lara, PD Espinosa-García, FJ García-Rodríguez, YM Medina-Medrano, JR Gutiérrez-Hernández, GF Ceja-Torres, LF (2021). In VitroAntifungal activity of Plant Extracts on Pathogenic Fungi of Blueberry (Vacciniumsp.). Plants 10(5):852. 10.3390/plants10050852. Hernández-Ceja A Loeza-Lara PD Espinosa-García FJ García-Rodríguez YM Medina-Medrano JR Gutiérrez-Hernández GF Ceja-Torres LF 2021 In Vitro Antifungal activity of Plant Extracts on Pathogenic Fungi of Blueberry (Vaccinium sp.) Plants 10.3390/plants10050852 Jadeja, KB Bhatt, HR (2010). Mango stem end rot management with Carbendazim. Indian Phytopathology 63(1):103-105. Jadeja KB Bhatt HR 2010 Mango stem end rot management with Carbendazim Indian Phytopathology Jahanshir, A Dzhalilov, FS (2010). The effects of fungicides onFusarium oxysporumf. sp.lycopersiciassociated with Fusarium wilt of Tomato. Journal of Plant Protection Research 50(2):172-178. Jahanshir A Dzhalilov FS 2010 The effects of fungicides on Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici associated with Fusarium wilt of Tomato Journal of Plant Protection Research Leslie, JF Summerell, BA (2006). TheFusariumLaboratory Manual. Blackwell Publishing Professional. Ames, Iowa, USA.. Leslie JF Summerell BA 2006 The Fusarium Laboratory Manual Blackwell Publishing Professional. Ames, Iowa, USA. Li, B Li, Q Xu, Z Zhang, N Shen, Q Zhang, R (2014). Responses of beneficialBacillus amyloliquefaciensSQR9 to different soil-borne fungal pathogens through the alteration of antifungal compounds production. Frontiers in Microbiology 5:636. 10.3389/fmicb.2014.00636. Li B Li Q Xu Z Zhang N Shen Q Zhang R 2014 Responses of beneficial Bacillus amyloliquefaciens SQR9 to different soil-borne fungal pathogens through the alteration of antifungal compounds production Frontiers in Microbiology 10.3389/fmicb.2014.00636 Liang, L Li, H Zhou, L Chen, F (2020). Lasiodiplodia pseudotheobromaecauses stem canker of Chinese hackberry in China. Journal of Forestry Research 1:2571-2580. 10.1007/s11676-019-01049-x. Liang L Li H Zhou L Chen F 2020 Lasiodiplodia pseudotheobromae causes stem canker of Chinese hackberry in China Journal of Forestry Research 10.1007/s11676-019-01049-x Linaldeddu, BT Deidda, A Scanu, B Franceschini, A Serra, S Berraf-Tebbal, A Boutiti, MZ Jamâa, MLB Phillips, AJL (2015). Diversity ofBotryosphaeriaceaespecies associated with grapevine and other woody hosts in Italy, Algeria and Tunisia, with descriptions ofLasiodiplodia exiguaandLasiodiplodia mediterraneasp. nov.. Fungal Diversity 71:201-214. 10.1007/s13225-014-0301-x. Linaldeddu BT Deidda A Scanu B Franceschini A Serra S Berraf-Tebbal A Boutiti MZ Jamâa MLB Phillips AJL 2015 Diversity of Botryosphaeriaceae species associated with grapevine and other woody hosts in Italy, Algeria and Tunisia, with descriptions of Lasiodiplodia exigua and Lasiodiplodia mediterranea sp. nov. Fungal Diversity 10.1007/s13225-014-0301-x Madhavi, GB Bhattiprolu, SL (2011). Evaluation of fungicides, soil amendment practices and bioagents againstFusarium solanicausal agent of wilt disease in chilli. Journal of Horticultural Sciences 6(2):141-144. 10.24154/jhs.v6i2.423. Madhavi GB Bhattiprolu SL 2011 Evaluation of fungicides, soil amendment practices and bioagents against Fusarium solani causal agent of wilt disease in chilli Journal of Horticultural Sciences 10.24154/jhs.v6i2.423 Maraite, H Meyer, JA (1971). Systemic fungitoxic action of benomyl againstFusarium oxysporumf. sp.melonisin vivo. Netherlands Journal of Plant Pathology 77:1-5. 10.1007/BF01976392. Maraite H Meyer JA 1971 Systemic fungitoxic action of benomyl against Fusarium oxysporum f. sp. melonis in vivo Netherlands Journal of Plant Pathology 10.1007/BF01976392 Mardanova, MA Hadieva, GF Lutfullin, MT Khilyas, IV Minnullina, LF Gilyazeva, AG Bogomolnaya, LM Sharipova, MR (2017). Bacillus subtilisstrains with antifungal activity against phytopathogenic fungi. Agricultural Sciences 8(1):1-20. 10.4236/as.2017.81001. Mardanova MA Hadieva GF Lutfullin MT Khilyas IV Minnullina LF Gilyazeva AG Bogomolnaya LM Sharipova MR 2017 Bacillus subtilis strains with antifungal activity against phytopathogenic fungi Agricultural Sciences 10.4236/as.2017.81001 Medina-Osti, F Gutiérrez-Díez, A Ochoa-Ascencio, S Sinagawa-García, SR (2022). In vitrosensitivity ofFusarium sacchariisolated from sugar cane to five fungicides. Revista Mexicana de Fitopatología 40(3):447-457. Medina-Osti F Gutiérrez-Díez A Ochoa-Ascencio S Sinagawa-García SR 2022 In vitro sensitivity of Fusarium sacchari isolated from sugar cane to five fungicides Revista Mexicana de Fitopatología Medina-Urrutia, VM Robles-González, MM Becerra-Rodríguez, S Orozco-Romero, J Orozco-Santos, M Garza-López, JG Ovando-Cruz, ME Chávez-Contreras, X (2002). El cultivo de limón mexicano. Libro Técnico Núm. 1. Campo Experimental Tecomán. INIFAP-SAGARPA. México. 188p.. Medina-Urrutia VM Robles-González MM Becerra-Rodríguez S Orozco-Romero J Orozco-Santos M Garza-López JG Ovando-Cruz ME Chávez-Contreras X 2002 El cultivo de limón mexicano Libro Técnico Núm. 1. Campo Experimental Tecomán. INIFAP-SAGARPA. México. 188p. Mondragón-Flores, A Rodríguez-Alvarado, G Gómez-Dorantes, N Guerra-Santos, JJ Fernández-Pavía, SP (2021). Botryosphaeriaceae: una familia de hongos, compleja, diversa y cosmopolita. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 12(4):643-654. Mondragón-Flores A Rodríguez-Alvarado G Gómez-Dorantes N Guerra-Santos JJ Fernández-Pavía SP 2021 Botryosphaeriaceae: una familia de hongos, compleja, diversa y cosmopolita Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas Monroy, CL Lizarazo, FL (2010). Identificación de hongos fitopatógenos asociados al Roble (Quercus humboldtiiBonpl.) en los municipios de Encino (Santander), Arcabuco, y Tipacoque (Boyacá). Colombia Forestal 13(2):347-356. Monroy CL Lizarazo FL 2010 Identificación de hongos fitopatógenos asociados al Roble (Quercus humboldtii Bonpl.) en los municipios de Encino (Santander), Arcabuco, y Tipacoque (Boyacá) Colombia Forestal Moreira-Morrillo, AA Cedeño-Moreira, ÁV Canchignia-Martínez, F Garcés-Fiallos, FR (2021). Lasiodiplodia theobromae(Pat.) Griffon & Maul [(sin.) Botryodiplodia theobromae Pat] en el cultivo de cacao: síntomas, ciclo biológico y estrategias de manejo. Scientia Agropecuaria 12(4):653-662. 10.17268/sci.agropecu.2021.068. Moreira-Morrillo AA Cedeño-Moreira ÁV Canchignia-Martínez F Garcés-Fiallos FR 2021 Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griffon & Maul [(sin.) Botryodiplodia theobromae Pat] en el cultivo de cacao: síntomas, ciclo biológico y estrategias de manejo Scientia Agropecuaria 10.17268/sci.agropecu.2021.068 Morton, DJ Stroube, WH (1955). Antagonistic and stimulatory effects of soil microorganisms uponSclerotium rolfsii. Phytopathology 45(8):417-420. Morton DJ Stroube WH 1955 Antagonistic and stimulatory effects of soil microorganisms upon Sclerotium rolfsii Phytopathology Osorio, HE Hernández, CFD Rodríguez, HR Varela, FSE Drouaillet, EB López, SJA (2016). Actividad antagónica deTrichodermaspp. sobreRhizoctonia solaniin vitro. Investigación y Ciencia 24(67):5-11. Osorio HE Hernández CFD Rodríguez HR Varela FSE Drouaillet EB López SJA 2016 Actividad antagónica de Trichoderma spp. sobre Rhizoctonia solani in vitro Investigación y Ciencia Patil, VA Mehta, BP Deshmukh, JA Bavalgave, VG (2019). Fungicides for the Management of Grey Leaf Blight (Pestalotia anacardii) of Mango. International Journal of Economic Plants 6(2):90-92. 10.23910/IJEP/2019.6.2.0311. Patil VA Mehta BP Deshmukh JA Bavalgave VG 2019 Fungicides for the Management of Grey Leaf Blight (Pestalotia anacardii) of Mango International Journal of Economic Plants 10.23910/IJEP/2019.6.2.0311 Phillips, AJL Alves, A Abdollahzadeh, J Slippers, B Wingfield, MJ Groenewald, JZ Crous, PW (2013). TheBotryosphaeriaceae: genera and species known from culture. Studies in Mycology 76(1):51-167. 10.3114/sim0021. Phillips AJL Alves A Abdollahzadeh J Slippers B Wingfield MJ Groenewald JZ Crous PW 2013 The Botryosphaeriaceae: genera and species known from culture Studies in Mycology 10.3114/sim0021 Picos-Muñoz, PA García-Estrada, RS León-Félix, J Allende-Molar, R (2015). Lasiodiplodia theobromaeen Cultivos Agrícolas de México: Taxonomía, Hospedantes, Diversidad y Control. Revista Mexicana de Fitopatología 33(1):54-74. Picos-Muñoz PA García-Estrada RS León-Félix J Allende-Molar R 2015 Lasiodiplodia theobromae en Cultivos Agrícolas de México: Taxonomía, Hospedantes, Diversidad y Control Revista Mexicana de Fitopatología Polanco, FLG Alvarado, GOG Pérez, GO González, GR Olivares, SE (2019). Hongos asociados con la muerte regresiva de los cítricos en Nuevo León y Tamaulipas, México. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 10(4):757-764. Polanco FLG Alvarado GOG Pérez GO González GR Olivares SE 2019 Hongos asociados con la muerte regresiva de los cítricos en Nuevo León y Tamaulipas, México Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas Rajnish, K Gautam, HR (2022). Prevalence and Management ofPestalotiaLeaf Spot (Pestalotiasp.) of Strawberry. International Journal of Economic Plants 9(3):250-254. Rajnish K Gautam HR 2022 Prevalence and Management of Pestalotia Leaf Spot (Pestalotia sp.) of Strawberry International Journal of Economic Plants Rocha-Peña, MA López-Arroyo, JI Peña del Río, MA (2003). Manejo integrado de enfermedades en el cultivo de los cítricos. Memorias XVI Curso de Actualización Frutícola II, Fundación Salvador Sáenz-Colín, Coatepec Harinas, Estado de México. Rocha-Peña MA López-Arroyo JI Peña del Río MA 2003 Manejo integrado de enfermedades en el cultivo de los cítricos Memorias XVI Curso de Actualización Frutícola II, Fundación Salvador Sáenz-Colín, Coatepec Harinas, Estado de México Romero-Velázquez, SD Tlapal-Bolaños, B Cadena-Iñiguez, J Nieto-Ángel, D Arévalo-Galarza, M de L (2015). Hongos causantes de enfermedades postcosecha en chayote (Sechium edule(Jacq.) SW.) y su controlin vitro. Agronomía Costarricense 39(2):19-32. 10.15517/rac.v39i2.21769. Romero-Velázquez SD Tlapal-Bolaños B Cadena-Iñiguez J Nieto-Ángel D Arévalo-Galarza M de L 2015 Hongos causantes de enfermedades postcosecha en chayote (Sechium edule (Jacq.) SW.) y su control in vitro Agronomía Costarricense 10.15517/rac.v39i2.21769 Rusin, CF Gioloni de, LPC Duarte, RCM Kurtz, AMA Vasconcelos, BR (2020). Control of the fungiLasiodiplodia theobromae, the causal agent of dieback, in cv. Syrah grapevines. Acta Scientiarum. Agronomy 43:e44785. 10.4025/actasciagron.v43i1.44785. Rusin CF Gioloni de LPC Duarte RCM Kurtz AMA Vasconcelos BR 2020 Control of the fungi Lasiodiplodia theobromae, the causal agent of dieback, in cv. Syrah grapevines Acta Scientiarum. Agronomy 10.4025/actasciagron.v43i1.44785 Sáenz, PCA Osorio, HE Estrada, DB Poot, P Delgado, MR Rodríguez, HR (2019). Principales enfermedades en cítricos. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 10(7):1653-1665. 10.29312/remexca.v10i7.1827. Sáenz PCA Osorio HE Estrada DB Poot P Delgado MR Rodríguez HR 2019 Principales enfermedades en cítricos Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas 10.29312/remexca.v10i7.1827 Sultana, N Ghaffar, A (2010). Effect of fungicides and microbial antagonists in the control ofLasiodiplodia theobromae, the cause of seed rot, seedling and root infection of bottle gourd. Pakistan Journal of Agricultural Research 23:46-52. Sultana N Ghaffar A 2010 Effect of fungicides and microbial antagonists in the control of Lasiodiplodia theobromae, the cause of seed rot, seedling and root infection of bottle gourd Pakistan Journal of Agricultural Research Úrbez-Torres, JR Battany, M Bettiga, LJ Gispert, C McGourty, G Roncoroni, J Smith, RJ Verdegaal, P Gubler, WD (2010). Botryosphaeriaceaespecies spore-trapping studies in California vineyards. Plant Disease 94(6):717-724. 10.1094/PDIS-94-6-0717. Úrbez-Torres JR Battany M Bettiga LJ Gispert C McGourty G Roncoroni J Smith RJ Verdegaal P Gubler WD 2010 Botryosphaeriaceae species spore-trapping studies in California vineyards Plant Disease 10.1094/PDIS-94-6-0717 Valle-de la Paz, M Guillén-Sánchez, D Alia-Tejacal, I López-Martínez, V Juárez-López, P Martínez-Fernández, E Hernández-Arenas, M Ariza-Flores, R (2019). Controlin vitrodeLasiodiplodia theobromae(Pat.) Griff. & Maulb yL. citricolaAbdollahz aislados de lima persa (Citrus latifoliaTanaka) en Morelos, México. Acta Agrícola y Pecuaria 5(1):4-10. 10.30973/aap/2019.5.0051001. Valle-de la Paz M Guillén-Sánchez D Alia-Tejacal I López-Martínez V Juárez-López P Martínez-Fernández E Hernández-Arenas M Ariza-Flores R 2019 Control in vitro de Lasiodiplodia theobromae (Pat.) Griff. & Maulb y L. citricola Abdollahz aislados de lima persa (Citrus latifolia Tanaka) en Morelos, México Acta Agrícola y Pecuaria 10.30973/aap/2019.5.0051001 Zárate-Ramos, A Quero-Carrillo, AR Miranda-Jiménez, L Nava-Díaz, C Robles-Yerena, L (2022). Fungicides andBacillus subtilisagainst fungi isolated from commercial seed of Side oats grama (Bouteloua curtipendula). Revista Mexicana de Fitopatología 40(1):103-115. 10.18781/r.mex.fit.2104-4. Zárate-Ramos A Quero-Carrillo AR Miranda-Jiménez L Nava-Díaz C Robles-Yerena L 2022 Fungicides and Bacillus subtilis against fungi isolated from commercial seed of Side oats grama (Bouteloua curtipendula) Revista Mexicana de Fitopatología 10.18781/r.mex.fit.2104-4 Articles Control biológico y químico in vitro de hongos asociados a la gomosis en cítricos en Yucatán, México Resumen Antecedentes/Objetivo.

En todas las regiones productoras de cítricos en el mundo la gomosis es una enfermedad que ha causado pérdidas en la producción de cítricos. Esta enfermedad es causada por varios patógenos. Los objetivos fueron, identificar los hongos asociados a la gomosis en huertas de cítricos de Plan Chac, Sacalum, Yucatán; y evaluar alternativas químicas y biológicas para el control de los hongos asociados a la gomosis.

 Materiales y Métodos.

A partir de tejido vegetal y suelo, se aislaron los hongos asociados. Los aislamientos se identificaron morfológicamente en el tejido vegetal como Lasiodiplodia pseudotheobromae y en suelo como Fusarium solani y Pesta- lotia spp. La prueba de patogenicidad determinó que L. pseudotheobromae es un agente asociado a ésta enfermedad. Los aislamientos fueron sometidos a pruebas in vitro con fungicidas químicos y agentes antagonistas.

 Resultados y Discusión.

El Tiabendazol mostró efectividad para F. solani con una concentración efectiva para inhibir el 50 % de la población (CE50) de 0.0612 mg L-1, para Pestalotia spp. se inhibió el crecimiento a todas las concentraciones evaluadas y para L. pseudotheobromae, mostró una CE de 0.0049 mg L . En el caso de Bacillus subtilis cepa QST 713, disminuyó el crecimiento de F. solani (CE 0.0496 mg L ), Pestalotia spp. (CE 0.0487 mg L ) y L. pseudotheobromae (CE 0.0528 mg L-1). Por otro lado, Trichoderma harzianum mostró una mayor inhibición contra F. solani, Pestalotia spp. y L. pseudotheobromae del 61.08, 62.93 y 35.64 %, respectivamente.

 Conclusión.

En el manejo de gomosis en cítricos se puede incluir con eficiencia el uso de agentes biológicos como Trichoderma y B. subtilis ofreciendo alternativas con menor impacto en el medio ambiente.

 Palabras clave: Bacillus inhibición micelial Lasiodiplodia Tiabendazol Tricho- derma. Introduccion

Distintos agentes fitopatógenos han sido asociados a la gomosis de los cítricos. Se ha reportado principalmente a especies del género Phytophthora (Bright et al., 2004; Brentu y Vicent, 2015; Graham y Feichtenberger, 2015). Sin embargo, los miembros de la familia Botryosphaeriaceae han mostrado relevancia debido a su capacidad de adaptación para enfermar a otros cultivos cercanos a las parcelas de hospedantes nativos originales (Mondragon-Flores et al., 2021).

La gomosis se encuentra distribuida en todas las zonas citrícolas del mundo. Ha causado pérdidas en Italia (Aloi et al., 2021), Argelia (Linaldeddu et al., 2015; Berraf-Tebbal et al., 2020), Irán (Abdollahzadeh et al., 2010) y Estados Unidos (Adesemoye et al., 2014), y en México se encuentra distribuida en las zonas pro- ductoras de cítricos dulces y en limones Mexicano y Persa de los estados de: Co- lima (Rocha-Peña et al., 2003), Morelos (Valle-de la Paz et al., 2019a), Puebla, Veracruz (Bautista-Cruz et al., 2019), Nuevo León y Tamaulipas (Polanco et al., 2019) con importantes daños que fluctúan del 2 al 14 % de incidencia (Medina- Urrutia et al., 2002).

Los síntomas en tallos y ramas se observan en lesiones necrosadas y la aparición de un exudado gomoso, posteriormente marchitez, amarillamiento de hojas, defo- liación y finalmente muerte parcial o completa del árbol (Bautista-Cruz et al., 2019; Berraf-Tebbal et al., 2020; Aloi et al., 2021). El patógeno sobrevive en el rastrojo de plantas enfermas, y se disemina por medio de las herramientas de poda; pero también mediante lluvia, riego, viento e insectos (Moreira-Morillo et al., 2021). La enfermedad prevalece en mayor medida a temperaturas entre los 26 a 32 oC y alta humedad relativa (80 %) (Úrbez-Torres et al., 2010; Picos-Muñoz et al., 2015).

El control de la gomosis se ha eficientado con el uso de fungicidas químicos preventivos como Carbendazim (Da Silva Pereira et al., 2011; Valle-de la Paz et al., 2019b), Tiabendazol (Da Silva Pereira et al., 2011; Camacho-Tapia et al., 2021), Benomilo y compuestos a base de cobre (Everett y Timudo-Torrevilla, 2007; Sáenz et al., 2019; Valle-de la Paz et al., 2019). También se han usado microorganis- mos antagonistas como Trichoderma spp. y Bacillus subtilis (Bhuvaneswari y Rao, 2001; Rusin et al., 2021). Sin embargo, la aplicación de fungicidas químicos se debe revisar según el patógeno de estudio, así como evitar la generación de resis- tencia. Procurar alternativas biológicas para el control es importante para la con- servación de la biodiversidad. Este estudio se ha desarrollado con los objetivos de identificar los patógenos asociados a la gomosis en huertas de cítricos de Plan Chac, Sacalum, Yucatán; y evaluar alternativas de control químico y biológico que ofrezcan alternativas al manejo de la enfermedad.

Materiales y métodos

Material vegetal y aislamiento de hongos. Se usaron muestras del tejido vegetal (corteza) y de suelo provenientes de un huerto semicomercial con árboles de na- ranjo (Citrus sinensis), limón (C. latifolia) y toronjo (C. paradisi) con síntomas de exudado y necrosis. El huerto se encuentra ubicado en la localidad de Plan Chac, Sacalum, Yucatán. Las muestras fueron extraídas en julio y octubre de 2023. Para los aislamientos del tejido se cortaron fragmentos (5 mm2) que se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1 % por un minuto y se lavaron tres veces con agua destilada estéril (Bautista-Cruz et al., 2019). Los tejidos se dejaron secar en papel absorbente estéril y después se sembraron en cajas con medio PDA natural (200 g papa, 20 g agar-agar, 15 g de dextrosa en 1000 mL de agua) y se incubaron a 24 °C por 24 h. Las muestras de suelo fueron tomadas alrededor del tronco de árboles con sín- tomas y a una profundidad de 30 cm. Para el aislamiento de los hongos del suelo, la técnica consistió en diluciones seriadas; así en el primer tubo se añadió 1 g de suelo en 9 mL de agua destilada estéril, posteriormente se transfirió 1 mL de esa solución (suelo-agua) a una serie de tubos con las mismas características (Aziz y Zainol, 2018). Se hicieron tres diluciones de cada muestra (10-1 hasta 10-3). Se transfirieron 20 µL de la solución final en cajas con medio PDA natural que se incubaron a 24 °C durante 24 h y se observaron al microscopio para detectar crecimiento fúngico.

 Purificación de aislados e identificación.

La purificación de los aislados se obtuvo mediante punta de hifa y se sembraron en medio PDA (BD BIOXON®, Cuautitlán Izcalli, México) y se mantuvieron durante un periodo de 7 a 14 días a 24 °C en in- cubadora (BINDER, Modelo BD53-UL, Tuttlingen, Alemania). La caracterización morfológica de los aislamientos purificados se llevó acabo con los siguientes me- dios de cultivo: PDA con antibióticos (39 g, 200 mg de estreptomicina y 1000 mL de agua,) y Agar Hoja de Clavel (CLA) (20 g agar, 1000 mL de agua, cinco fragmentos de hojas de clavel por cada caja). En el medio PDA, se determinó la pigmentación y la tasa de crecimiento de las colonias. Para estudiar la morfología del género Fu- sarium se usó medio CLA y cámaras húmedas (caja Petri, papel húmedo y trozos de aluminio) que se evaluaron a los cinco días para la medición de fiálides. Adicio- nalmente, se midieron macro y microconidios y clamidosporas; para Pestalotia se midieron conidios; y para Lasiodiplodia se midieron conidios maduros y picnidios. Después del periodo de incubación se hicieron preparaciones semipermanentes de glicerina al 50 % de cada aislado y se examinaron con un microscopio óptico (Leica DM500, Heerbrugg, Alemania) con cámara digital instalada, con un objetivo de 40x y las imágenes se procesaron a través del Software LAS EZ (versión 3.4; Leica Microsystems, Alemania).

 Prueba de patogenicidad.

Con base en la mayor incidencia encontrada en los aislados, se inocularon con L. pseudotheobromae cuatro plantas de C. sinensis in- jertada en naranja agria C. aurantium. Se desinfectó la superficie del tejido sano de la planta con alcohol al 70 %, y se practicó una herida en donde se colocó un disco de crecimiento activo de L. pseudotheobomae en PDA (5 mm) de cinco días de edad (Bautista-Cruz et al., 2019; Berraf-Tebbal et al., 2020). Se sellaron las heridas con algodón húmedo y papel tipo Parafilm (Bemis, EEUU). Las plantas testigo recibieron un disco PDA estéril. Las plantas fueron evaluadas en condiciones de microtúnel durante 21 días, con temperatura media de 24 °C (máx. 47 °C, mín. 11 °C) y humedad relativa de 97 % (máx. 100 %, mín. 85 %). Una vez cul- minado el periodo, se observó la presencia de signos y síntomas pertenecientes a la gomosis. Se utilizaron las hojas y tallos con lesiones, y se reaislaron los hongos en medio PDA. Cuando se desarrolló la colonia, se llevó a cabo la caracterización morfológica y cultural, para confirmar la presencia de estructuras que coincidan con el aislado original.

 <bold>Evaluación <italic>in vitro</italic> de fungicidas químicos y antagonistas.</bold>

La técnica consistió en la siembra de los aislados en medio PDA con fungicida a diversas concentra- ciones (Dhingra y Sinclair, 1995). Se extrajo un disco de inóculo de 5 mm de la periferia de la colonia pura del hongo en cuestión. Se evaluaron cuatro fungici- das químicos (Benomilo, Mancozeb, Carbendazim, Tiabendazol) y un producto biológico a base de B. subtilis cepa QST 713. Para los tres aislados, se usaron 7 concentraciones con tres repeticiones, incluido el testigo (Cuadro 1). Las concen- traciones se calcularon según el volumen de medio PDA e ingrediente activo. Se incubaron a una temperatura de 24 °C. Se obtuvieron los porcentajes de inhibición del crecimiento micelial (PICM) y la concentración efectiva (CE). Una vez que el crecimiento micelial del testigo ocupó el área total de la caja de Petri, se calculó el porcentaje de crecimiento de cada uno de los tratamientos con la fórmula de Arce- Araya et al., (2019): % crecimiento del hongo= [(Diámetro del hongo en PDA

Tratamientos evaluados para el control de hongos fitopatógenos asociados a la gomosis de los cítri- cos en Plan Chac, Sacalum, Yucatán.
Hongo Producto comercial Principio activo (i.a.) Concentraciones evaluadas (mg/L)
Fusarium solani Carbendazim Carbendazim a 500 g 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0
Tecto Tiabendazol a 600 g 0, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0
Benomilo Benomil a 500 g 0, 0.01, 1.0, 5.0, 10, 50, 100
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0
Pestalotia spp. Benomilo Benomil a 500 g 0, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100
Mancozeb Mancozeb a 800 g 0, 0.1, 1, 10, 50, 100, 500
Tecto Tiabendazol a 600 g 0, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10.0, 100
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0
Lasiodiplodia pseudotheobromae Mancozeb Mancozeb a 800 g 0, 0.1, 1.0, 10, 50, 100, 500
Benomilo Benomil a 500 g 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10
Tecto Tiabendazol a 600 g 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0, 5.0, 10
Serenade Bacillus subtilis cepa QST 713 a 146 g 0, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0

sin fungicida-Diámetro del hongo en PDA con fungicida) / (Diámetro del hongo en PDA sin fungicida) * 100]. La CE que inhibe el 50 % del crecimiento micelial (CE50) se calculó mediante el Software GraphPad Prism (versión 8.0.1; GraphPad, San Diego, CA).

Prueba dual in vitro de Trichoderma .

Para evaluar la capacidad antagónica de Trichoderma, se utilizó la técnica de cultivo dual descrita por Morton y Stroube (1955). Se realizó la prueba con los agentes fitopatógenos obtenidos, y dos agentes antagonistas: Trichoderma harzianum y T. viride que pertenecen a la colección del INIFAP. La prueba consistió en colocar un disco de micelio de cada hongo (5 mm) en un extremo de la caja Petri y en el otro extremo se colocó un disco del agente antagonista (5 mm), a una separación de 2 cm. Para cada tratamiento se incluye- ron tres repeticiones y un testigo. Se mantuvieron a una temperatura de 24 °C. Al culminar el periodo se calculó el % de inhibición radial (PICR) con la fórmula de Osorio et al. (2016): PICR= [(Diámetro del hongo sin Trichoderma-Diámetro del hongo con Trichoderma) / (Diámetro del hongo sin Trichoderma) * 100].

 Análisis estadístico.

El diseño experimental utilizado fue completamente al azar. Se realizó un análisis de varianza y una comparación de medias con la prueba de Tukey (P ≤ 0.05). Los resultados se analizaron con el software estadístico SAS (versión 9.0; SAS Institute, Cary, N.C.).

 Resultados y discusión

Caracterización morfológica de hongos asociados a la gomosis. De las muestras vegetales, se obtuvieron colonias que corresponden a un solo hongo, con las siguientes características: un crecimiento circular de color blanco y de borde filamentoso con textura esponjada que se tornó a color verde militar y finalmente a negro (Figura 1a). Se presentaron picnidios de 133 µm de ancho x 212.69 µm de largo con

Anverso y reverso de aislamientos en medio de cultivo PDA de hongos asociados a la go- mosis de los cítricos. <bold>A)</bold> Colonia de <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> de seis días de edad, obtenida de tejido de la corteza. <bold>B)</bold> Colonia de <italic>Fusarium solani</italic> de seis días de edad. <bold>C)</bold> Colonia de <italic>Pestalotia</italic> spp<italic>.</italic> de seis días de edad, ambos obtenidos del suelo.

conidios que medían (17.75-) 25.30 (-34.97) µm de largo x (11.37-) 13.30 (-18.08) µm de ancho, de forma subovoide a elipsoide, con ápice y base truncada (Figura 2). Los conidios son inicialmente hialinos y aseptados, y posteriormente septados de color café con estriado longitudinal. Además, se presentaron otras estructuras como células conidiógenas y paráfisis. Estas características corresponden a las descritas por Phillips et al. (2013) y Liang et al. (2020) para L. pseudotheobromae.

Morfología microscópica de cuerpos fructíferos de <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae.</italic> <bold>A, B</bold> y <bold>C)</bold> Conidiomas picnidiales globosos, <bold>D)</bold> conidios maduros septados con estriados longi- tudinales, <bold>E)</bold> células conidiógenas y paráfisis y <bold>F)</bold> conidios aseptados inmaduros.

De las muestras de suelo, se obtuvieron colonias con crecimiento circular de color crema con borde filamentoso y de textura plana que se tornó a una tonali- dad café claro (Figura 1b). Los macroconidios triseptados ligeramente curvos de (28.99-) 35.02 (-42.76) µm de largo por (4.18-) 5.18 (-6.99) µm de ancho. Los microconidios con uno o sin septo de (6.86-) 10.02 (-14.08) µm de largo por (5.24-) 3.75 (-2.41) µm de ancho. Las fiálides largas y cilíndricas de 97.30 µm, y clamidosporas de doble pared, terminales o intercalares de 8.69 µm de diámetro (Figura 3). La anterior descripción coincide con F. solani (Leslie y Summerell,

Morfología microscópica de <italic>Fusarium solani</italic> asociado a la gomosis de los cítricos<italic>.</italic> <bold>A)</bold> Fiáli- des y conidios agrupados en cabezuelas, <bold>B)</bold> Macroconidios maduros septados, <bold>C)</bold> Microco- nidios maduros.

2006). Adicionalmente, se obtuvo una tercera colonia de color blanco con forma- ción de anillos circulares, de textura algodonosa y bordes filamentosos (Figura 1c). Presencia de acérvulos de 506 µm y conidios curvos de (13.19-) 21.61 (-28.07) µm de largo por (5.93-) 8.01 (-9.97) µm de ancho, con cinco células de extremos hia- linos (terminal y apical). El extremo terminal presentó tres apéndices que medían 4.96-30.3 µm, 5.33-31.06 µm y 5.28-29.81 µm. Por otro lado, el extremo apical de un solo apéndice corto de 2.86-7.83 µm de largo. Está descripción coincide con el género Pestalotia, sin que se pueda diferenciar una especie de acuerdo con Guba (1961) y Barnett y Hunter (1998).

 Prueba de patogenicidad de aislamientos.

A los 21 días se observaron lesiones necrosadas con exudados ámbar en tallos, así como presencia de picnidios en tallos y hojas (Figura 4). Similar a lo obtenido por Bautista-Cruz et al. (2019) y Berraf- Tebbal et al. (2020). Se confirmó que el agente causal de la enfermedad de la gomo- sis corresponde a L. pseudotheobromae, a través de los postulados de Koch.

 Efectividad de fungicidas.

Los resultados obtenidos permitieron identificar al fungicida con mayor efectividad para disminuir el crecimiento micelial de F. sola- ni, Pestalotia spp. y L. pseudotheobromae. Para F. solani, el análisis de varianza mostró diferencias significativas entre Carbendazim, Tiabendazol y Serenade (P ≤ 0.05). El Tiabendazol fue el fungicida químico más efectivo debido a que a dosis mínimas logró inhibir a F. solani (Cuadro 2, Figura 5). Los benzimidazoles como el

Síntomas y signos ocasionados por <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> en cítricos, A) necrosamiento de tallos, B) presencia de picnidios en tallos, y C) producción de exudado o goma.

Concentración media efectiva (CE ) (mg L<sup>-1</sup>) de cada fungicida probado para la inhibición del crecimiento micelial <italic>in vitro</italic> de <italic>Fusarium solani</italic> obtenidos de huertas de cítricos en Plan Chac, Sacalum, México.
Fungicidas Media CE50 Valor óptimo CE50 Intervalo de confianza al 95%
Benomilo 0.4807 az 0.4150 0.2687 a 0.6068
Carbendazim 0.4274 ab 0.4243 0.3477 a 0.5037
Tiabendazol 0.0612 b 0.0610 0.05179 a **
Serenade 0.04970 b 0.0496 0.04613 a 0.05303

Medias con la misma letra dentro de la columna, son estadísticamente iguales según la prueba Tukey (P ≤ 0.05). NA= No aplica. ** = Indefinido. Valor de P = 0.0121.

Carbendazim y Tiabendazol han sido efectivos para controlar al género Fusarium (Agrios, 2005). Zárate-Ramos et al. (2022) determinaron que el Tiabendazol fue efectivo con CE50 de 14.50 mg L-1 contra F. incarnatum, mientras que Medina-Osti et al. (2022) reportaron que Tiabendazol fue efectivo a una CE50 de 7.2 mg L-1 contra F. sacchari. También, el producto biológico Serenade fue efectivo (Cuadro 2, Figura 5). Se ha reportado que las bacterias del género Bacillus producen com- ponentes antimicrobianos contra Fusarium (Mardanova et al., 2017). En el caso de F. solani, para inhibir más del 50 % del hongo, fue necesario una concentración

Efecto <italic>in vitro</italic> de fungicidas contra hongos asociados a la gomosis de los cítricos en cinco días. Crecimeinto de <italic>Fusarium solani</italic>: <bold>A)</bold> Medio con Tiabendazol al 0.5 mg L<sup>-1</sup>. <bold>B)</bold> Medio con Carbendazim al 0.8 mg L<sup>-1</sup>. <bold>C)</bold> Medio con Benomil al 50 mg L<sup>-1</sup>. <bold>D)</bold> Testigo. Crecimiento de <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic>: <bold>E)</bold> Medio con Tiaben- dazol al 0.01 mg L<sup>-1</sup>. <bold>F)</bold> Medio con Benomil al 0.1 mg L<sup>-1</sup>. <bold>G)</bold> Medio con Mancozeb al 50 mg L<sup>-1</sup>. <bold>H)</bold> Testigo. Crecimiento de <italic>Pestalotia</italic> spp.: <bold>I)</bold> Medio con Tiabendazol al 0.01 mg L<sup>-1</sup>. <bold>J)</bold> Medio con Benomil al 1 mg L<sup>-1</sup>. <bold>K)</bold> Medio con Mancozeb al 100 mg L<sup>-1</sup>. <bold>L)</bold> Testigo.

de 0.0497 mg L-1 (Cuadro 2). Carbendazim mostró ser eficiente para inhibir su cre- cimiento micelial (Cuadro 2, Figura 5). En general, el Carbendazim ha mostrado buenos resultados contra F. oxysporum en tomate (Jahanshir y Dzhalilov, 2010) y contra F. solani en chile (Madhavi y Bhattiprolu, 2011). González-Oviedo et al. (2022) reportaron que cepas de F. oxysporum, provenientes de vainilla, fueron sen- sibles a Benomilo y Carbendazim. Sin embargo, el Benomilo fue menos efectivo, dado que el mayor porcentaje de inhibición se presentó a concentraciones elevadas (Cuadro 2, Figura 5). La aplicación de Benomilo al suelo restringió la colonización de F. oxysporum en melón (Maraite y Meyer, 1971). Se ha demostrado que el Be- nomilo reduce el índice de germinación de las conidias de Fusarium (Decallonne y Meyer, 1972). Romero-Velázquez et al. (2015) determinaron que se presentó una CE50 del 0.01 mg L-1 por B. subtilis contra Fusarium en chayote. Por otro lado, Zarate-Ramos et al. (2022) indicaron que B. subtilis fue eficiente con CE50 0.00014 mg L-1, e inhibió completamente a Fusarium a 0.01, 0.05 y 1 mg L-1,

Por otra parte, el análisis de varianza (P ≤ 0.05) para Pestalotia spp. mostró que existen diferencias significativas entre Benomilo y Mancozeb. El Tiabenda- zol mostró ser el más efectivo en todas las concentraciones evaluadas (Cuadro 3). Hernández-Ceja et al. (2021), reportaron que Tiabendazol a partir de 5 mg mL-1 logró inhibir el 100 % de hongos asociados a la muerte regresiva del arándano: Pestalotiopsis clavispora, Colletotrichum gloeosporioides y L. pseudotheobromae. Con Serenade se obtuvo un valor óptimo de CE 0.04870 mg L-1. Monroy y Liza- razo (2010), no encontraron propiedades antagonistas contra Pestalotia spp., con la siembra del hongo con bacterias Pseudomonas fluorescens y B. subtilis a una concentración 106 UFC/mL8 en PDA. El Mancozeb fue el menos efectivo (Cuadro 3). La inhibición del 100 % del hongo se logró con la aplicación de la dosis más alta evaluada. En fresa, Ara et al. (2017) y Rajnish & Gauta, (2022), lograron inhibir a Pestalotia spp. completamente a concentraciones de 250, 500 y 1000 mg L-1. Por otro lado, el Carbendazim y Mancozeb fueron los que controlaron a P. anacardii en mango (Patil et al., 2019).

Concentración media efectiva (CE ) (mg L<sup>-1</sup>) de cada fungicida probado para la inhibición del crecimiento micelial <italic>in vitro</italic> de <italic>Pestalotia</italic> spp. obtenidos de huertas de cítricos en Plan Chac, Sacalum, Yucatán.
Fungicidas Media CE50 Valor óptimo CE50 Intervalo de confianza al 95 %
Mancozeb 58.73 az 58.09 45.44 a 73.40
Benomilo 0.0819 b 0.06934 0.03579 a **
Serenade 0.0481 b 0.04870 0.04547 a 0.05117
Tiabendazol NA NA NA

Medias con la misma letra dentro de la columna, son estadísticamente iguales según la prueba Tukey (P ≤ 0.05). NA= No aplica. ** = Indefinido. Valor de P = 0.0001.

En L. pseudotheobromae el análisis de varianza indica que no hubo diferencias significativas sobre la CE50 entre Benomilo, Serenade y Tiabendazol, sin embargo, si difieren estadísticamente con Mancozeb (P ≤ 0.05). El Tiabendazol fue efecti- vo, ya que mostro un valor de CE50 menor (Cuadro 4, Figura 5) y presentó mayor inhibición a partir de 0.01 mg×L-1 (98.55 %). Los benzimidazólicos han sido efec- tivos contra L. theobromae. En 120 aislados de L. theobromae se determinó que

91.6 % fueron sensibles a benzimidazólicos con CE50 de 0.36 al 1.27 µg mL-1 para Tiabendazol (Da Silva et al., 2012). En condiciones de campo, Camacho-Tapia et al. (2021) demostraron que la aplicación de Tiabendazol, permitió un buen control de la gomosis en limón. El control con Benomilo se logró a concentraciones bajas

Concentración media efectiva (CE ) (mg L<sup>-1</sup>) de cada fungicida probado para la in- hibición del crecimiento micelial <italic>in vitro</italic> de <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> obte- nidos de huertas de cítricos en Plan Chac, Sacalum, Yucatán.
Fungicidas Media CE50 Valor óptimo CE50 Intervalo de confianza al 95 %
Mancozeb 20.96 az 25.59 -
Benomilo 0.0638 b 0.0638 0.04696 a **
Serenade 0.0528 b 0.0528 0.05052 a 0.05537
Tiabendazol 0.0049 b 0.0056 **

Medias con la misma letra dentro de la columna, son estadísticamente iguales según la prueba Tukey (P ≤ 0.05). ** = Indefinido (GraphPad Prism no muestra un intervalo de confianza com- pleto). Valor de P = 0.0004.

( Cuadro 4, Figura 5), la inhibición de Lasiodiplodia se logró la aplicación de 0.1 mg L-1 (86.58 %) y se inhibió completamente a 10 mg×L-1 (99.56 %). Similar a lo obtenido por Da Silva Pereira et al. (2021), donde la CE50 de Benomilo para L. the- obromae fue de 0.002 a 1.75 µg mL-1. También, algunas especies de Botryosphae- riaceae fueron controlados con Benomilo (CE a 0.36 a 0.55 µg mL-1) (Bester et al., 2007). La aplicación de Benomilo y compuestos a base de oxicloruro de cobre contra L. theobromae es efectiva en distintas fases fenológicas del cultivo (Sáenz et al., 2019). El Serenade fue menos efectivo, con valor de CE a 0.0528 mg L-1. El Mancozeb logró controlar a L. pseudotheobromae a altas concentraciones de 50, 100, 500 mg L-1, en comparación con los fungicidas evaluados. Esto último lo confirman Dianda et al. (2020) y Sultana y Ghaffar (2010), dado que se inhibió completamente a Lasiodiplodia a 100 y 500 mg L-1. El Mancozeb en conjunto con Carbendazim ha permitido un control más amplio (Jadeja y Bhatt, 2010; Valle- de la Paz et al., 2019b). Por otro lado, Sultana y Ghaffar (2010), obtuvieron buenos resultados con la aplicación de B. subtilis en el control de pre y post-emergencia en el control de L. theobromae.

 <bold>Efecto de <italic>Trichoderma</italic>.</bold>

Tanto T. harzianum como T. viride inhibieron el desarrollo de los hongos asociados a la gomosis de los cítricos; sin embargo, de acuerdo con el ANVA, T. harzianum causó la mayor inhibición. Se ha reportado su efectividad como agente de control biológico contra hongos, nematodos e insectos (Ferreira y Musumeci, 2021). En F. solani, el ANVA indica que T. harzianum (61.08 %) mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (22.17 %) (P ≤ 0.05) (Cuadro 5, Figura 6). También, Fernández y Suárez (2009) reportaron que la apli- cación de T. harzianum inhibió más del 50 % de Fusarium en maracuyá. En beren- jenas, Ganesh y Dwivedi (2019) reportaron que se inhibió alrededor del 20 % de

Porcentaje de inhibición de crecimiento micelial por efec- to de <italic>Trichoderma</italic> en contra <italic>F. solani</italic>, <italic>Pestalotia</italic> spp. y <italic>L. pseudotheobromae</italic>.
Patógeno Tratamientos Media
Fusarium solani T. harzianum 61.08 az
T. viride 22.17 b
Valor P 0.0001
DMS 5.549
Pestalotia spp. T. harzianum 62.93 az
T. viride 53.78 a
Valor P 0.0001
DMS 14.76
Lasiodiplodia pseudotheobromae T. harzianum 35.64 az
T. viride 25.45 a
Valor P 0.0001
DMS 4.856

Medias con la misma letra dentro de la columna, no difieren estadísti- camente según la prueba Tukey (P ≤ 0.05). DMS; Diferencia mínima significativa.

Fusarium con T. viride. Madhavi y Bhattiprolu (2011) indican que la integración de distintos tratamientos como el baño de las plántulas con Carbendazim, la adición de vermicompost, el empapado con fungicida y la aplicación de T. viride es eficaz para el control de la enfermedad del marchitamiento por Fusarium en chile. Para Pestalotia, el análisis de varianza (P ≤ 0.05) indica que T. harzianum (62.93 %) mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (53.78 %) (Cuadro 5, Figura 6). En mango, se logró inhibir al hongo con la aplicación de Trichoderma (72.88 %) (Bhuvaneswari y Rao, 2001). En el caso de Lasiodiplodia, el ANVA (P < 0.05) indica que T. harzianum (35.64 %) no mostró diferencias significativas en comparación con T. viride (25.45 %) (Cuadro 5, Figura 6). Boat et al. (2022), determinaron que T. harzianum redujo el 64.1 % de L. theobromae. Mientras que Bhuvaneswari y Rao (2001) reportaron que el 62.41 % del crecimiento micelial del hongo fue reducido. Asimismo, Da Silva et al. (2022) demostraron que Tricho- derma redujo el crecimiento de F. solani (34 %) y L. theobromae (89 %) asociado a Nopalea cochinillifera. En Morelos, se encontró que L. citricola fue sensible a todas las dosis evaluadas de T. harzianum (0.55, 0.39 y 0.19 g/100 mL) (Valle-de la Paz, 2019a).

Efecto de <italic>Trichoderma</italic> spp. en el desarrollo de hongos asociados a la gomosis de los cítricos. <bold>A)</bold> <italic>Fusarium solani vs T. harzianum.</italic> <bold>B)</bold> <italic>F. solani</italic> vs <italic>T. viride.</italic> <bold>C)</bold> <italic>Pestalotia</italic> spp vs <italic>T. harzianum</italic>. <bold>D)</bold> <italic>Pestalotia</italic> vs <italic>T. viride.</italic> <bold>E)</bold> <italic>Lasiodiplodia pseudotheobromae</italic> vs <italic>T. harzianum.</italic> <bold>F)</bold> <italic>L. pseudotheobromae</italic> vs <italic>T. viride</italic>.

Conclusiones

La identificación morfológica y las pruebas de patogenicidad mostraron que la enfermedad de la gomosis en cítricos provenientes de la localidad de Plan Chac en Sacalum, Yucatán es causada por L. pseudotheobromae. Además, se identifi- caron otros hongos fitopatógenos: Pestalotia spp. y F. solani. El tratamiento con Tiabendazol, B. subtilis cepa QST 713 y T. harzianum controlan eficientemente F. solani, L. pseudotheobromae y Pestalotia spp. El manejo de la gomosis en cítricos se puede realizar en combinación con el uso de agentes biológicos, disminuyendo así el uso del control químico y evitando una probable resistencia con su uso a largo plazo.