rmfiRevista mexicana de fitopatologíaRev. mex. fitopatol0185-33092007-8080Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C.10.18781/R.MEX.FIT.2024-34ArticlesThe genus Bacillus as biological control agent against pests and pathogens for sustainable agriculturaParra-CotaFannie Isela¹BrunoIsabeli² García-MontelongoMónica³González-VillarrealSebastián⁴Villarreal-DelgadoMaría Fernanda⁵Córdova-AlboresLiliana Carolina⁶Escalante-BeltránAlina⁷Santos-VillalobosSergio de los⁸¹ Campo Experimental Norman E. Borlaug, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias, CP. 85000, Ciudad Obregón, Sonora, México.Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y PecuariasInstituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias85000Ciudad ObregónSonoraMexico² Área de Agrometeorología, Ecofisiología y Tecnología de Alimentos, Instituto de Desarrollo Rural de Paraná (IAPAR-EMATER), Londrina 86047-902, Brasil.Instituto de Desarrollo Rural de Paraná (IAPAR-EMATER)Instituto de Desarrollo Rural de Paraná (IAPAR-EMATER)Brazil³ Laboratorio Estatal de Salud Pública de Durango, 34206, Nombre de Dios 1206, José Ángel Leal, Durango, México.Laboratorio Estatal de Salud Pública de DurangoLaboratorio Estatal de Salud Pública de Durango34206DurangoMexico⁴ Laboratorio Estatal de Salud Pública de Durango, 34206, Nombre de Dios 1206, José Ángel Leal, Durango, México.Laboratorio Estatal de Salud Pública de DurangoLaboratorio Estatal de Salud Pública de Durango34206José Ángel LealDurangoMexico⁵ Sartorius de México, Libramiento Norte de Tepotzotlán, S/N Int. 5, CP 54605, Tepotzotlán, Estado de México.Sartorius de MéxicoSartorius de MéxicoMexico⁶ Licenciatura en Agrobiotecnología, Centro Universitario del Sur, Universidad de Guadalajara, Enrique Arreola Silva No. 883, Ciudad Guzmán, Jalisco, México, CP 49000.Universidad de GuadalajaraUniversidad de GuadalajaraCiudad GuzmánJalisco49000Mexico⁷ Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de Febrero 818 Sur, Col. Centro, CP 85000, Ciudad Obregón, Sonora, MéxicoInstituto Tecnológico de SonoraInstituto Tecnológico de Sonora85000Ciudad ObregónSonoraMexico⁸ Instituto Tecnológico de Sonora, 5 de Febrero 818 Sur, Col. Centro, CP 85000, Ciudad Obregón, Sonora, MéxicoInstituto Tecnológico de SonoraInstituto Tecnológico de Sonora85000Ciudad ObregónSonoraMexico191120242024424RMEXFIT2024341007202408112024This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution LicenseABSTRACT:Background/Objective
. Bacteria of the Bacillus genus have been studied since their discovery in 1872, for their ability to synthesize metabolites of interest such as proteins used to control phytopathogens. The objective of this research was to analyze the most outstanding species of the Bacillus genus, as well as the main compounds produced by these species, and the perspectives on the use of this bacterial genus for pest and disease control.
Materials and Methods.
An exhaustive search was carried out in scientific articles and books to gather the most relevant information regarding the Bacillus genus, focusing on its role as a biological control agent for pests and pathogens.
Results
. The Bacillus genus includes more than 427 taxa, which can be classified into different groups. Among the biological control agents (BCA) are the Bacillus cereus group, which includes B. cereus, B. anthracis, and B. thuringiensis, and the B. subtilis group, which includes B. subtilis, B. licheniformis, and B. pumilus, mainly. B. thuringiensis, through cry genes, has molecular mechanisms to synthesize a crystalline inclusion during sporulation, which contains proteins known as endotoxins or Cry proteins. B. subtilis produces substances with a high potential for biological control, such as volatile organic compounds, as well as bioactive secondary metabolites.
Conclusion
. The potential of the Bacillus genus to be used as biological control agents is evident. They are widely used for the development of different biopesticides that have advantages over other products. However, it is necessary to continue conducting research from the in vitro area in the laboratory to the field, to help guarantee their biosecurity and effectiveness.
The increase in the global population and the impact of climate change indicates that the food demand will double by 2050, which is currently satisfied by 80% by the agricultural sector (FAO, 2017). However, some of the factors that limit productivity and generate between 20 and 40% of losses in agricultural productivity are plant diseases caused by fungi, bacteria, viruses, and nematodes) (de los Santos-Villalobos et al., 2021; García-Montelongo et al., 2023). Due to the rising interest in controlling diseases of agricultural interest, the study and use of plant growth-promoting microorganisms (PGPM), as well as biological control agents (BCA) has grown in recent decades, as well as its use in the formulation of biopesticides incorporated in the Integrated Pest and Disease Management (IPDM). Conventionally, pests and diseases in plants are controlled with the use of chemical pesticides that contribute to the increase of environmental issues and consume a large volume of resources (de los Santos-Villalobos et al., 2021; Montoya-Martínez et al., 2024). Microorganisms have a wide range of action mechanisms to protect plants and control pathogens. Some interact through competition for space and nutrients, parasitism, and antibiosis to interfere directly with the pathogen, whereas other interactions with plants can be produced by induced resistance (García-Montelongo et al., 2023). Through the bioprospecting of selected strains as BCAs, it is possible to identify metabolites of interest; these should be identified, characterized, purified and their biological properties evaluated, while also monitoring their biocontrol activity(Montoya-Martínez et al., 2024).
One of the most widely studied groups of endophytic and rhizosphere bacteria isolated are bacilli since they have been characterized as potential BCAs. The synthesis of enzymes with antibiotic activity (subtilin, subtilosin A, TasA, sublancin) is one of their antagonistic abilities, as well as the production of non-ribosomal peptides, which are synthesized by non-ribosomal peptide synthetases, such as bacilysin, bacilysin, chlorotetain, difficidin, mycobacillin and some rhizocytokine (Orozco-Mosqueda et al., 2021).
Bacillus has currently been reported as the genus with the most strains used for the production of biopesticides, making up more than 85% of commercial bacterial products, due to their metabolic versatility which, via several biological mechanisms, helps it control pests and diseases (Villarreal-Delgado et al., 2018).
This revision has the aim of critically analyzing the use of bacteria of the Bacillus genus, its main action mechanisms against pests and diseases in plants, as well as its implementation, free of biosecurity hazards, via the development of bioinoculants, since the scientific support of these products on their action mechanisms, ecological and biosecurity implications and their formulation are decisive for the development of sustainable agriculture.
<bold>THE <italic>Bacillus</italic> GENUS</bold>
The Bacillus genus was reported for the first time by Cohn (1872), who described it as bacteria that produce heat-resistant endospores (Villarreal-Delgado et al., 2018). This bacterial genus, belonging to the Bacteria kingdom; Phylus Firmicutes; Class Bacilli; Order Bacillales, and Family Bacillaceae is characterized by its aerobic or anaerobic facultative growth, Gram-positive species, bacillary morphology, flagellar motility and variable size (0.5 to 10 μm), optimum growth at a neutral pH, and a variable optimal temperature range, although most species are mesophilic (they grow between 30 and 45 °C) (Figure 1). Its ability to produce endospores as a resistance mechanism is also noteworthy, and gives it the ability to prevail in ecosystems, even under adverse conditions (de los Santos-Villalobos et al., 2018; San Miguel-González et al., 2024).
Currently, this genus includes over 427 taxons with a publicly validated name (Parte et al., 2020). Taxons, due to their genetic similarity, can be classified into different groups, the main BCAs include the group of Bacillus subtilis, composed of B. subtilis, B. licheniformis, and B. pumilus, and the B. cereus group, which includes B. cereus, B. anthracis, and B. thuringiensis, mainly; a wide variety of species of the Bacillus genus has displayed antagonistic activity against different phytopathogenic microorganisms that affect crops such as maize, rice, and others (Villarreal-Delgado et al., 2018).
<bold>
<italic>Bacillus</italic> AS BIOINSECTICIDES</bold>
Biopesticides are a particular type of biological product, focused on the control of agricultural pests based on a living microorganism or a natural product (García De León and Mier, 2010). These may be classified into three types, according to the active substance: i) biochemical products, ii) semi-chemical products, and iii) microorganisms (Villarreal-Delgado et al., 2018). The Bacillus genus has been
Macroscopic characteristics of <italic>Bacillus cereus</italic> (A) and <italic>B. subtilis</italic> (B), belonging to the Culture Collection of Native Soil and Endophytic Microorganisms, grown at 28 °C in nutrient agar (COLMENA) (www.itson. edu.mx/COLMENA) (<xref ref-type="bibr" rid="B20">de los Santos-Villalobos <italic>et al</italic>., 2018</xref>).
widely studied due to its ability to produce spores, which facilitates its storage, encapsulation, and later application on the field, its wide metabolic diversity related to its prevalence in ecosystems and its ability to reduce the incidence of pests and diseases in crops (Santoyo et al., 2019; Valenzuela-Ruíz et al., 2020).
<italic>Bacillus thuringiensis (Bt)</italic>
Bacillus thuringiensis (Bt), through cry genes, has molecular mechanisms to produce toxins; it synthesizes a crystalline inclusion during sporulation, which contains proteins known as endotoxins or Cry proteins (Sarwar, 2015).
Crickmore et al. (2016) have created a special database for Bt toxins, which includes links to information on host insects and is currently updating (https:// www.bpprc.org/ consulted on May 30th, 2024), in which around 950 genes of toxins that codify different etomopathogenic proteins in Bt strains isolated from different parts of the world (Galvis and Moreno, 2018) have been identified and characterized. Most of these toxins, produced during the phase of sporulation, are parasporal inclusions; these contain crystalline proteins known as delta-endotoxins, classified into two families: Cry and Cyt (Jouzani et al., 2017).
The δ-endotoxins (Cry) are toxic to a wide range of insect pests, such as Lepidoptera, Coleoptera and Diptera (Maksimov et al., 2020). Bt normally comprises a large family of several subspecies, each one categorized by different phylogenetic serotyped characteristics (such as Bt subsp. kurstaki, Bt subsp. aizawai, Bt subsp. tenebrionis, Bt subsp. israelensis, etc.); in addition, every subspecies of Bt includes multiple strains and serotypes(Bravo et al., 2011).
In addition to the Cry proteins, other protein inclusions have been described, called Cyt proteins, which, unlike Cry proteins, have a much lower molecular mass (approximately 27 kDa) and also display cytolytic activity (Bravo et al., 2007). Currently, over 300 cry genes have been reported from Bt, classifying into 73 Cry families and 3 Cyt families (Porcar and Juárez, 2004; Xu et al., 2014). Both Cry and Cyt proteins are produced during the sporulation phases and are known for their specific toxic effects on a large variety of invertebrates, mainly Diptera, Lepidoptera, Coleoptera, and nematodes (Pérez-García et al., 2011; Soberón et al., 2007).
Cry proteins are highly specific regarding their form of action, and are present in sporangia in an inactive way. After the autolysis of the sporangium, the protein crystals are released, which become toxic after they are ingested by susceptible insects and partially digested in the midgut of the insect (Bravo et al., 2011). The action mechanism begins once the Cry proteins are proteolytically processed through proteases found in the midgut of the host, separating a section of amino acids in the N-terminal region and in the C-terminal end (depending on the nature of the Cry protein), thus releasing active and toxic fragments that interact with the receptor proteins found in the intestinal cells of the larva (Figure 2). These fragments are recognized by the specific receptors in the membrane and inserted through the cadherin, giving succession to a series of signals for the formation of an oligomeric pre-porous structure, and consequently the lithic porous, through which an osmotic imbalance is produced, which finally destroys the intestinal epithelium and consequently, the death of the cell (Portela-Dussán et al., 2013; Xu et al., 2014). It is important to mention that Bt is not responsible for the death of the insect per se, but once there is damage to the intestine of the insect, diverse bacteria of the intestine pass onto the hemolymph, and finally, the insect dies of septicemia. This action mechanism has been described in Lepidoptera, and other orders such as Coleoptera, nematodes, and Diptera, the mechanism has not been entirely elucidated (Vachon et al., 2012). The key factors for this event are the presence of specific proteases, an alkaline environment, and the presence of specific receptors in the intestine of the insect, which explains that toxins are only effective in a small range of hosts and therefore often have a limited effect on non-target populations
Cry proteins. 1-A) Primary structure, showing the organization of the domains of representative members from each Cry family, 2-A) Conserved tertiary structure, showing the positions of the three domains. B) Mechanism of action of Cry proteins in insects, initiating once the Cry proteins are proteolytically processed by proteases in the midgut of the host, separating an amino acid section in the N-terminal region and at the C-terminal end (depending on the nature of the Cry protein), thus releasing active and toxic fragments that interact with receptor proteins in the insect’s intestinal cells. Modified from <xref ref-type="bibr" rid="B70">Villarreal-Delgado <italic>et al</italic>., 2018</xref>.; <xref ref-type="bibr" rid="B21">de Maagd <italic>et al</italic>., 2001</xref>; <xref ref-type="bibr" rid="B71">Xu <italic>et al</italic>., 2014</xref>.
(Cawoy et al., 2011). Additionally, the genes that codify the Cry/Cyt proteins are activated during the sporulation because they are controlled by a polymerase RNA that is also specifically synthesized while the spores are formed (Sanahuja et al., 2011).
Despite the diversity of amino acid sequences, all Cry proteins share a similar general tertiary structure, as noticed in the six structures solved so far using X-ray crystallography X (Cry1Aa, Cry2Aa, Cry3Aa, Cry3Bb, Cry4Aa, and Cry4Ba); the C-terminal portion is involved in the formation of crystals, but it is not a part of the mature toxin, since a large part of it lies in the gut of the insect; the N-terminal portion is the toxin itself and it comprises three domains: domain I is a set of seven α-helices, six of which are amphipathic and surrounds the seventh hydrophobic helix; this domain is responsible for the insertion of the membrane and the formation of lithic pores; domain II consists of three antiparallel β-sheets with exposed loop regions; domain III is a β-sandwich (Figure 2); domains I and II confer receptor- binding specificity, which helps define the host range (Boonserm et al., 2006). On the other hand, the Cyt proteins bind directly to the lipid bilayer of intestinal cells and are composed of a single domain consisting of a β-sheet surrounded by two α-helices (Cohen et al., 2008, 2011).
Diverse investigations have reported the potential of Cry proteins in controlling pests of agricultural importance. Niedmann and Meza-Basso (2006) displayed the potential of Bt for the control of the tomato leafminer (Tuta absoluta), highlighting that in tomato leaf trials added with Cry protein concentrates extracted from the Bt strains LM-11, LM-12, LM-14 and LM-33, a mortality of 20 of 60% of the T. absoluta larvae was achieved. Investigations have also been reported in which Cry protein extracts taken from the Bt strains LBIT-13, LBIT-44, LBIT-383, LBIT-418, and LBIT-428 proved to have a toxic effect on the fall armyworm (Spodoptera frugiperda) (Vázquez-Ramírez et al., 2015).
The use of Bt is not limited to the control of agricultural pests, since its serovariety B. thuringiensis subsp. israelensis (Bti), discovered by Goldberg and Margalit (1977) in the Negev desert in Israel, has been used and sold for its high activity for the control of mosquitos and other Diptera of medical importance. Bti synthesizes three Cry proteins (Cry4A, Cry4B, and Cry11A) and one Cyt protein (Cyt1A); this combination is attributed to the high toxicity of Bti, as well as the lack of reports of resistance generation in susceptible insects (da Silva Carvalho et al., 2018).
Vegetative insecticide proteins (Vip) are other interesting proteins derived from Bt, which are produced during the vegetative state of this bacteria. They include the binary toxin Vip1 and Vip2 with specificity against Coleoptera and Vip3 with a wide spectrum of activity against Lepidoptera. The insecticidal potential of Vip1/ Vip2 has been proven on different pests such as the Coleoptera Sitophilus zeamais, known as the stored grain pest, and of Vip3 against the larvae of the Lepidoptera Spodoptera frugiperda and Helicoverpa zea, as well as against the cotton bollworm, Helicoverpa armigera (Mnif and Ghribi, 2015).
Other less studied Bt insecticidal toxins include secreted insecticidal proteins (Sip), which are proteins of approximately 41 kDa with reported activity against Coleoptera, and the β-exotoxins. These, as in Sip proteins, are secreted during the vegetative phase. Nevertheless, β-exotoxins are secondary metabolites secreted only by certain strains of Bt. Its toxic effect is not limited to invertebrates, and can also be toxic to mammals, therefore the use of Bt strains able to synthesize
β-exotoxins is restricted in several parts of the Americas and Europe (Chattopadhyay and Banerjee, 2018; Liu et al., 2014; Palma et al., 2014).
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<italic>Bacillus</italic> AS BIOFUNGICIDES</bold>
Biofungicides in general can be defined as microorganisms or natural compounds that can control pathogens that cause diseases in plants (Abbey et al., 2019). There are multiple reports regarding the mode of action of various fungicidal agents:
Competence, in which the bio-fungicidal agent competes for nutritional factors (such as nitrogen or carbon) with fungi, limiting their growth.
Antibiosis, in which there are antagonistic biological interactions between organisms. Parasitism, a symbiosis in which one of the organisms subsists from the other, causing deterioration.
Induction of resistance, a mechanism in which the plant is induced to adopt biological measures that avoid the spreading of pathogens (García-Montelongo et al., 2023; Köhl et al., 2019).
Fungicides formulated with strains of the Bacillus genus offer several advantages over other microorganisms, as they form endospores and can tolerate extreme pH, temperature, and osmotic conditions. They can colonize the root surface, promote plant growth, and cause the lysis of fungal mycelium (El-Bendary et al., 2016).
<italic>Bacillus subtilis</italic>
Bacillus subtilis is one of the most widely studied and used species for its production of substances with a high potential for biological control, such as volatile organic compounds, as well as bioactive secondary metabolites (Andrić et al., 2020). Among these substances, lantibiotics stand out; they are low molecularweight peptides. These are antibiotics with a high level of antibacterial activity against Gram-positive bacteria, with subtilin being the most studied in the case of B. subtilis. This forms voltage-dependent pores in the cytoplasmic membranes of susceptible bacteria (Klein and Entian, 1994). Other lantibiotics synthesized by B. subtilis include plantazolicin, with a high selectivity against B. anthracis and ericin (Molohon et al., 2016; Stein et al., 2002). There are diverse antibiotics synthesized by B. subtilis, such as bacitracin, which acts mainly against Gram-positive bacteria by inhibiting the synthesis of peptidoglycan; bacilysin, which has activity against bacteria and fungi by inhibiting glucosamine synthesis and disrupting the formation of the microbial cell wall; and rhizocticin, an antibiotic with activity mainly against fungi by inhibiting threonine synthase, affecting the synthesis of proteins in susceptible fungi (Borisova et al., 2010; Molohon et al., 2016; Rajavel et al., 2009; Stein et al., 2002).
The repertoire of proteins of interest of B. subtilis also includes fengycins and iturins, which have an inhibiting effect on fungal growth and antagonistic activity with the cell membranes of fungi (Caulier et al., 2019). Other substances synthesized by B. subtilis with activity against plant pathogens are lipopeptides, low molecular- weight compounds with amphiphilic characteristics that protect plants by directly suppressing the growth of pathogens or inducing systemic resistance in host plants (Hashem et al., 2019). It is worth noting that the substances synthesized by B. subtilis not only have activity on their own but also can induce an immune response in plants, making them less susceptible to infections (Andrić et al., 2020).
The bacteria of the Bacillus subtilis species are widely studied for the biological control of phytopathogenic microorganisms, making their rational use easier; in this way, the United States Food and Drug Administration (USFDA) has granted this species the state “generally regarded as safe” (GRAS), thus being considered non-pathogenic (Cawoy et al., 2011). B. subtilis is a ubiquitous bacterial species found in various habitats and occupies diverse ecological niches. It has no history of pathogenicity by contact with the environment, thus proving to be a potential agent of biological control of phytopathogenic fungi, mosquitos, and harmful nematodes (Mnif and Ghribi, 2015; Ongena and Jacques, 2008). The survival of B. subtilis in the rhizosphere and therefore its high efficiency as a biopesticide is due to its metabolic diversity (lytic enzymes and antimicrobial compounds) and its ability to produce spores (Cawoy et al., 2011).
Diverse studies have reported the larvicide potential of metabolites (lipo- peptides) derived from B. subtilis, which have been used in effective formulations for the control of Drosophila melanogaster, the Diptera Culex quinquefasciatus, Anopheles stephensi, and Aedes aegypti, as well as the Lepidoptera Prays oleae, Spodoptera littoralis and Ephestia kuehniella (Mnif and Ghribi, 2015). Geetha and Manonmani (2008), reported that the pupal stages of A. stephensi, C. quinquefasciatus, and A. aegypti [LC50: 2, 7.3 and 11.8 mg mL-1, respectively] turned out to be more susceptible to the mosquitocidal lipopeptide that larval stages [LC50: 19, 23 y 34 mg mL-1, respectivamente]; a noteworthy aspect of these insecticidal compounds is the report of its stability and that they maintain their larvicidal, pupicidal and adulticidal ability under conditions such as an extreme pH, high temperatures, solar radiation/UV, as well as the action of proteases (Geetha and Manonmani, 2010; Ghribi et al., 2012).
On the other hand, other species of the Bacillus genus have been reported to have the ability for biological control. For example, Bacillus cereus is a spore- forming bacteria, widely distributed in the soil and used as a BCA. B. cereus is a natural facultative pathogen of A. aegypti, the main vector for chikungunya and dengue since they can colonize the guts of the larvae of the insects. The insecticidal activity of B. cereus against A. aegypti larvae was approximately 90%, with the lethal concentration (LC50) being 2.5 ± 0.71 mg mL-1 (Radhika et al., 2011). In addition, new species of this genus with interesting metabolic abilities may lead to potential antagonistic bioproducts into phytopathogens. B. cabrialesii is a new species of Bacillus, characterized as an endophytic of the wheat crop. Although this strain has displayed biocontrol to Bipolaris sorokiniana, its strategies as a plant growth promoter (phosphorous solubilizer, producer of indoles, increase in chlorophyll) may make its use even more interesting, to reduce the use, not only of synthetic pesticides, but also of the fertilization doses (de los Santos-Villalobos et al., 2018; Valenzuela-Aragón et al., 2019; Villa-Rodríguez et al., 2019).
<bold>COMMERCIAL USE OF <italic>Bacillus</italic>
</bold>
Microbial pesticides offer advantages over other groups of pesticides, including those derived from fungi and plants and zooids, since the organisms used in the microbial insecticides are, in general terms, essentially not toxic or pathogenic for wildlife, humans, or other organisms not broadly related to the target pest. In addition, they do not damage the environment or water quality and they offer an eco-friendlier alternative then chemical pesticides (Chandler et al., 2011; Sarwar, 2015). On the other hand, most microbial insecticides can be used alongside synthetic chemical insecticides because in most cases the microbial product is not deactivated or damaged by the effect of conventional insecticides (Mnif and Ghribi, 2015). Likewise, they may have a dual effect on the crops, since most BCAs have other mechanisms that improve the acquisition of nutrients and/or the development of the plant, as well as the soil properties, and also display the ability to stimulate the defense and other physiological processes of the plants, which may lead the treated crops to become more resistant to a variety of biotic and abiotic stress factors (Borriss, 2011; Sarwar, 2015). Additionally, biopesticides may be used when pests develop resistance to conventional pesticides.
An organism must fulfill several requirements before being released into the environment as a potential biopesticide, the most outstanding of which is that it must i) be highly specific and effective against the target pest, ii) display the potential to be processed successfully by a continuous production technology, iii) be available in formulations with a reasonable shelf life, iv) display stability and be harmless for humans, flora and non-target fauna (Menéndez and Paço, 2020). The Bacillus genus has been used as a model of study for agrobiotechnology for having different characteristics (Figure 3).
Characteristics of interest of <italic>Bacillus</italic> spp. for the formulation of bioinoculants.
For example, Bacillus thuringiensis (Bt) has been used as a biopesticide in agriculture, forestry, and the control of vectors of human diseases. Its advantages are the specific toxicity against target insects, the lack of polluting residues, and the safety of non-target organisms such as mammals, birds, amphibians, and reptiles (Sansinenea, 2012). Currently, products based on B. thuringiensis represent over 70% of the biopesticides sold globally (Figure 4) (Valenzuela Ruiz et al., 2024). Most Bt formulations are obtained from different strains, including B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk) strain HD1 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac and Cry2Aa); B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk) strain HD73 (Cry1Ac); B. thuringiensis subsp.
Evolution of the <italic>Bacillus</italic> genus as a biopesticide in the industry.
aizawai strain HD137 (Cry1Aa, Cry1B, Cry1Ca, and Cry1Da); B. thuringiensis subsp. tenebrionis (Cry3Aa) and B. thuringiensis subsp. israelensis (Cry4A, Cry4B, Cry11A, and Cyt1A) (Mnif y Ghribi, 2015). In Mexico, the use of Bt-based formulas represents an efficient alternative for the control of insects, presenting a percentage of use between 4 and 10% of the total insecticides used for the maize, cotton, and vegetable crops (Tamez Guerra et al., 2001). Additionally, other species of the Bacillus genus, such as B. subtilis, B. cereus, and B. licheniformis have also shown their insecticidal potential to control agricultural crop pests and vectors of human diseases (Villarreal-Delgado et al., 2018).
In recent years, the chemical pesticide production market has declined by 2% per annum, whereas the production of biopesticides displays an annual increase of 20% (Cheng et al., 2020). Among the reasons behind the growing interest in biopesticides is the low probability of pathogenic organisms developing resistance, the reduction in the discovery of new insecticides, a greater public awareness regarding the risks of synthetic pesticides, an increase in studies on the specificity of biopesticides, advances in the production and technology of formulations and dissemination, as well as a better interaction with farmers and regulating authorities (Olson et al., 2013; Olson, 2015).
It is important to highlight that the transition and integration of biopesticides in current agricultural practices must comply with certain requirements: a) effectiveness against the pest or disease, b) compatibility with other control methods, c) low or no environmental impact, d) long-lasting effect on the surroundings, e) profitability from the cost/benefit point of view, f) technical viability of its use, and g) acceptance by farmers and society in general. Therefore, its use is an opportunity to boost the development and modernization of current agricultural practices, contributing to food security through biosafety approaches (Villarreal-Delgado et al., 2018).
Current and future challenges of the use of the genus<bold>
<italic>Bacillus</italic> IN AGRICULTURE</bold>
There are key issues to improve the efficiency of biopesticides and the consistency of protection, among which strain selection stands out, as the most commonly used method is currently in vitro screening, due to it being easy to implement. It presents the disadvantage that it generally does not take into account the environmental conditions in which it will be used, making it necessary to optimize the selection process by using more realistic methods that include the linking of field observations and verifiable parameters (Cawoy et al., 2011).
Another aspect that must be taken into account to improve the efficiency of the biopesticides is the agro-system, that is, finding adequate combinations between biopesticides, chemical pesticides, plant fertilization, agricultural practices such as different types of tilling, as well as integrating them into a MIPE that includes cultivation practices, plant resistance, chemical control and other BCAs (Cawoy et al., 2011; Pérez-García et al., 2011; Van Der Heijden et al., 2008). The formulation and application methods are also key aspects worth considering that directly influence the efficiency of the biopesticides. For this, it is important to perform investigations on their application in specific environments, as well as to add compounds or other microorganisms to the formulations that are biocompatible and optimize the biological control activity (Cawoy et al., 2011; Correa et al., 2009). Likewise, it is necessary to study tolerance to heat, desiccation, exposure to ultraviolet radiation, as well as other types of stress that reduce the effectiveness of microbial insecticides. Consequently, special formulation, application, and storage procedures are needed for some microbial pesticides (Chandler et al., 2011).
We can therefore specify that every BCA is a particular organism that carries out its action in a specific way, in which the studies of each selected microbial strain must be deepened to increase knowledge on how to enhance its biological control through effective formulation, considering ecological risk aspects and biosafety for the agro-system. It is therefore also necessary to delve deep into the correct identification of the BCA to discard the use of strains that may be pathogenic to humans. Particularly, within the group of Bacillus cereus, which includes species such as B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. seudomycoides, B. cytotoxicus and B. weihenstephanensis, some strains have been identified as pathogenic to humans (Villarreal-Delgado et al., 2018).
The virulence of these species has been mainly associated with the presence of two toxins: hemolysin BL (HBL) and the non-hemolytic enteric toxin (NHE), which form a protein complex (Kim et al., 2015). In addition, other toxins have been found in pathogenic strains, including cytotoxin K (cytK), enterotoxin FM (entFM), enterotoxin S (entS), and enterotoxin T (bceT). Also involved in the pathogenicity of these strains are strains produced by other genes, such as hemolysin A (hlyA), hemolysin II and III (hlyI, hlyII), cereolysin A and B (cerA, cerB), and the pleiotropic transcription factor (pclR) (Ceuppens et al., 2013).
The classification and differentiation of species within the Bacillus cereus group have been carried out using gene 16S rRNA and other characteristics such as i) virulence (B. cereus), ii) content of plasmids (B. anthracis and B. thuringiensis), iii) growth conditions (B. cytotoxicus and B. weihenstephanensis) and iv) morphological characteristics (B. mycoides and B. seudomycoides). However, the differentiation between broadly related species, such as B. cereus, B. anthracis, and B. thuringiensis, is limited when virulence and plasmid content factors are used, due to the loss and transfer of these elements throughout their evolutionary history (Hoffmaster et al., 2006; Liu et al., 2015). Recent comparative studies of complete genomes using digital DNA-DNA Hybridization (dDDH) revealed a wide distribution of cry genes and pXO plasmids in members of this group. These studies proved that there is a low correlation between the phylogenetic position and the presence or absence of these plasmids; they also showed that the multi-locus analysis (MLST) has a low resolution for the differentiation at a species level (Liu et al., 2015).
To select and market the BCA of these species, it is necessary to identify and determine their virulence for human beings. The detection of the potential risk of these species can be carried out through taxonomy and β-hemolytic activity studies, and detection with defined virulence molecular markers, but the only accurate alternative for the classification and determination of its virulence is with the comparative genomic study using complete genomes. However, it is important to consider that these are costly tools, but as the genome sequences become more widely available, more in-depth studies can be conducted to ensure the biosafe strains in agriculture.
On the other hand, because the use of biopesticides has become highly relevant in the agricultural sector, which generally implies the application of large populations of the microorganism of interest to boost its establishment and colonization, studies on the environmental impact of the introduction of a BCA into agro-systems is necessary. This is because, under certain conditions, they may cause changes in the microbial communities with agro-ecologically unpredictable results, especially when BCAs are inoculated since their biological activity is not generally specific or selective for the phytopathogenic in question, which may lead to unpredictable changes in the microbial structure of these agro-systems (Trabelsi and Mhamdi, 2013). Therefore, it is important to monitor the impact of inoculating biological control agents on the structure and composition of microbial communities in agro- systems to ensure ecological balance, in addition to the desired insecticidal effect.
Acknowledgments
The authors would like to thank the National Institute of Forestry, Agriculture and Livestock Research (INIFAP) for funding the research project “Native soil microorganisms as a strategy to increase tolerance to biotic and abiotic stress in cereals” (11175835959). They also thank the funds provided by the Technological Institute of Sonora (PROFAPI_2024_0001), as well as the members of the Microbial Resources Biotechnology Laboratory (www.itson.mx/LBRM).
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Las bacterias del género Bacillus han sido estudiadas des- de su descubrimiento en 1872, por su capacidad de sintetizar metabolitos de interés como las proteínas utilizadas para el control fitopatógenos. El objetivo de la pre- sente investigación fue analizar las especies más destacadas del género Bacillus, así como los principales compuestos producidos por éstas, y las perspectivas en el empleo de este género bacteriano para el control de plagas y enfermedades.
Materiales y Métodos.
Se realizó una exhaustiva búsqueda en artículos y libros científicos para reunir y analizar críticamente la información más relevante respec- to al género Bacillus sobre su papel como agente de control biológico.
Resultados.
El género Bacillus incluye más de 427 taxones, los cuales pueden clasificarse en distintos grupos, destacando entre los agentes de control biológico (ACB) el grupo de Bacillus cereus, que incluye a B. cereus, B. anthracis, y B. thu- ringiensis y el grupo B. subtilis, comprendido por B. subtilis, B. licheniformis y B. pumilus, principalmente. B. thuringiensis, a través de genes cry, posee mecanismos moleculares para sintetizar una inclusión cristalina durante la esporulación, que contiene proteínas conocidas como endotoxinas o proteínas Cry. Bacillus subtilis produce sustancias con un alto potencial de control biológico, como lo son los com- puestos orgánicos volátiles, así como metabolitos secundarios bioactivos.
Conclusión.
Es evidente el potencial del género Bacillus para ser empleados como agentes de control biológico, son muy utilizados para el desarrollo de distintos bioplaguicidas que presentan ventajas sobre otros productos, sin embargo, es ne- cesario continuar realizando investigaciones desde el área in vitro en el laboratorio hasta el campo, para contribuir a garantizar su bioseguridad y efectividad.
Palabras clave<italic>:</italic>Bacterias benéficasagricultura sosteniblebiocontrolmecanismos de acción.Introducción
El incremento de la población humana a nivel mundial y el impacto del cambio climático indica que la demanda de alimentos se duplicará para el año 2050, la cual actualmente se satisface en un 80% por el sector agrícola (FAO, 2017). Sin embargo, algunos de los factores que limitan la productividad y generan entre un 20 y 40% de pérdidas en la producción agrícola son las enfermedades en las plantas causadas por hongos, bacterias, virus y nemátodos) (de los Santos-Villalobos et al., 2021; García-Montelongo et al., 2023). Debido al interés emergente de controlar enfermedades de importancia agrícola, el estudio y uso de microorganismos pro- motores de crecimiento vegetal (MPCV), así como agentes de control biológico (ACB) ha crecido en las últimas décadas así como su empleo en la formulación de bioplaguicidas incorporados en el Manejo Integral de Plagas y Enfermedades (MIPE). Convencionalmente, las plagas y enfermedades de las plantas se controlan mediante el uso de pesticidas químicos que contribuyen al aumento de problemas ambientales y consumen un gran volumen de recursos (de los Santos-Villalobos et al., 2021; Montoya-Martínez et al., 2024).
Los microorganismos poseen una amplia diversidad de mecanismos de acción
para proteger a las plantas y controlar patógenos. Algunos interactúan a través de competencia de espacio y nutrientes, parasitismo y antibiosis para interferir direc- tamente con el patógeno, mientras que otras interacciones con las plantas se pueden dar por resistencia inducida (García-Montelongo et al., 2023). Mediante la biopros- pección de cepas seleccionadas como ACB se pueden identificar metabolitos de interés; éstos deben de ser identificados, caracterizados, purificados y con sus pro- piedades biológicas evaluadas, asimismo contar con un monitoreo en su actividad biocontroladora (Montoya-Martínez et al., 2024).
Uno de los grupos de bacterias endofíticas y rizosféricas aisladas más estudiados son los bacilos, ya que han sido caracterizados como potenciales ACB. La síntesis de enzimas con actividad antibiótica (subtilina, subtilosina A, TasA, sublancina) es una de sus habilidades antagónicas, así como la producción de péptidos de origen no ribosómico, los cuales son sintetizados por péptidos sintetasas no ribosómicas, como bacilena, bacilisina, clorotetaina, difficidina, micobacilina y algunas rizoci- tocinas (Orozco-Mosqueda et al., 2021).
Actualmente, se ha reportado que Bacillus es el género con cepas más utilizadas para la producción de bioplaguicidas, componiendo más del 85% de los productos bacterianos comerciales, esto debido a su gran versatilidad metabólica que, me- diante diversos mecanismos biológicos, le permite controlar plagas y enfermedades (Villarreal-Delgado et al., 2018).
La presente revisión tiene como objetivo analizar críticamente el uso bacterias del género Bacillus, sus principales mecanismos de acción contra plagas y enfermedades en plantas, así como su implementación, sin riesgos a la bio- seguridad, mediante el desarrollo de bioinoculantes, ya que el sustento científico de estos productos sobre sus mecanismos de acción, implicaciones ecológicas y de bioseguridad y su formulación son determinantes para el desarrollo de una agricultura sustentable.
<bold>El género <italic>Bacillus</italic>
</bold>
El género Bacillus fue reportado por primera vez por Cohn (1872), quien lo describió como bacterias productoras de endosporas resistentes al calor (Villarreal- Delgado et al., 2018). Este género bacteriano, perteneciente al Reino Bacteria; Filo Firmicutes; Clase Bacilli; Orden Bacillales y Familia Bacillaceae. Se caracteriza por su crecimiento aerobio o anaerobio facultativo, especies Gram positivas, mor- fología bacilar, movilidad flagelar, y tamaño variable (0.5 a 10 μm), crecimiento óptimo a pH neutro, un rango de temperatura óptima variable, aunque la mayoría de las especies son mesófilas (crecen entre 30 y 45 ⁰C) (Figura 1). También destaca su capacidad de producir endosporas como mecanismo de resistencia, lo cual le confiere la capacidad de prevalecer en los ecosistemas aún bajo condiciones adver- sas (de los Santos-Villalobos et al., 2018; San Miguel-González et al., 2024).
Actualmente, este género incluye más de 427 taxones con un nombre válida- mente publicado (Parte et al., 2020). Los taxones, por su similitud genética, pueden clasificarse en distintos grupos, destacando entre los ACB el grupo de Bacillus subtilis, comprendido por B. subtilis, B. licheniformis y B. pumilus, y el grupo de B. cereus, que incluye a B. cereus, B. anthracis, y B. thuringiensis, principalmente; una amplia variedad de especies del género Bacillus ha mostrado actividad antagó- nica contra diferentes microorganismos fitopatógenos que afectan cultivos agríco- las como el maíz, el arroz, entre otros (Villarreal-Delgado et al., 2018).
Características macroscópicas de <italic>Bacillus cereus</italic> (A) y <italic>B. subtilis</italic> (B), pertenecientes a la Colección de Microorganismos Edáficos y Endófitos Nativos, crecidas a 28 °C en agar nutritivo (COLMENA) (<ext-link ext-link-type="uri" xlink:href="http://www/">www.</ext-link> itson.edu.mx/COLMENA) (<xref ref-type="bibr" rid="B20">de los Santos-Villalobos <italic>et al</italic>., 2018</xref>).
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<italic>Bacillus</italic> COMO BIOINSECTICIDAS</bold>
Los bioplaguicidas son un tipo particular de productos biológicos, enfocados en el control de plagas agrícolas a base de un microorganismo vivo o un producto natural (García De León y Mier, 2010). Éstos pueden ser clasificados en tres tipos de acuer- do con la sustancia activa: i) productos bioquímicos, ii) productos semi-químicos, y iii) microorganismos (Villarreal-Delgado et al., 2018). El género Bacillus ha sido ampliamente estudiado debido a su capacidad de producir esporas, lo cual facilita su almacenamiento, encapsulación y posterior aplicación en campo, su amplia di- versidad metabólica relacionada con su prevalencia en ecosistemas y su habilidad de reducir la incidencia de plagas y enfermedades en cultivos (Santoyo et al., 2019; Valenzuela-Ruíz et al., 2020).
<italic>Bacillus thuringiensis (Bt)</italic>
Bacillus thuringiensis (Bt), a través de genes cry, posee mecanismos moleculares para producir toxinas; ésta sintetiza una inclusión cristalina durante la esporulación, que contiene proteínas conocidas como endotoxinas o proteínas Cry (Sarwar, 2015).
Crickmore et al. (2016) han creado una base de datos especial para toxinas de Bt, la cual incluye enlaces a información sobre insectos hospedadores y se actualiza continuamente (https://www.bpprc.org/ consultado el 30 de mayo de 2024), donde se han identificado y caracterizado alrededor de 950 genes de toxinas que codifican diferentes proteínas entomopatógenas en cepas de Bt aisladas de diversas partes del mundo (Galvis y Moreno, 2018). La mayoría de estas toxinas, producidas duran- te la fase de esporulación, son inclusiones parasporales; éstas contienen proteínas cristalinas conocidas como delta-endotoxinas, clasificadas en dos familias: Cry y Cyt (Jouzani et al., 2017).
Las δ-endotoxinas (Cry) son tóxicas para una amplia variedad de plagas de in- sectos, como lepidópteros, coleópteros y dípteros (Maksimov et al., 2020). Bt nor- malmente comprende una gran familia de varias subespecies, cada una categoriza- da por características filogenéticas y serotipadas distintas (como Bt subsp. kurstaki, Bt subsp. aizawai, Bt subsp. tenebrionis, Bt subsp. isarelensis, etc.); además, cada subespecie de Bt incluye múltiples cepas y serotipos (Bravo et al., 2011).
Además de las proteínas Cry, se han descrito otras inclusiones proteicas denomi- nadas proteínas Cyt, las cuales a diferencia de las proteínas Cry, tienen una mucho menor masa molecular (aproximadamente 27 kDa) y además presentan actividad citolítica (Bravo et al., 2007). Actualmente se han reportado más de 300 genes cry de Bt, clasificándose en 73 familias Cry y 3 familias Cyt (Porcar & Juárez, 2004; Xu et al., 2014). Tanto las proteínas Cry como las proteínas Cyt son producidas durante la fase de esporulación, y son conocidas por sus efectos tóxicos específicos sobre una gran variedad de invertebrados, principalmente dípteros, lepidópteros, coleópteros y nemátodos (Pérez-García et al., 2011; Soberón et al., 2007).
Las proteínas Cry son altamente específicas con respecto a su modo de acción, están presentes en los esporangios en una forma inactiva. Tras la autolisis del espo- rangio se liberan los cristales de proteína, los cuales una vez ingeridos por insectos susceptibles y digeridos parcialmente en el intestino medio del insecto, se vuelven tóxicas (Bravo et al., 2011). El mecanismo de acción inicia una vez que las pro- teínas Cry son procesadas proteolíticamente a través de proteasas presentes en el intestino medio del hospedero, separando una sección de aminoácidos en la región N-terminal y en el extremo C-terminal (dependiendo de la naturaleza de la proteína Cry), liberando así fragmentos activos y tóxicos que interactúan con las proteínas receptoras presentes en células intestinales de la larva (Figura 2). Estos fragmentos son reconocidos por receptores específicos en la membrana, e insertados a través de la caderina, dando sucesión a una serie de señales para la formación de una estruc- tura oligomérica pre-poro, y consecuentemente el poro lítico, por el cual se efectúa un desequilibrio osmótico, que finalmente destruye el epitelio intestinal y en consi- guiente la muerte celular (Portela-Dussán et al., 2013; Xu et al., 2014).
Proteínas Cry. 1-A) Estructura primaria, mostrando la organización de los dominios de miembros representativos de cada familia Cry, 2-A) Estructura terciaria conservada, mostrando las posiciones de los tres dominios. B) Mecanismo de acción de las proteínas Cry en insectos, iniciando una vez que las proteínas Cry son procesadas proteolíticamente por proteasas en el intestino medio del hospedero, separando una sección de aminoácidos en la región N-terminal y en el extremo C-terminal (dependiendo de la naturaleza de la proteína Cry), liberando así fragmentos activos y tóxicos que interactúan con las proteínas receptoras presentes en células intestinales del insecto. Modificado de <xref ref-type="bibr" rid="B70">Villarreal-Delgado <italic>et al.</italic>, 2018</xref>.; <xref ref-type="bibr" rid="B21">de Maagd <italic>et al</italic>., 2001</xref>; <xref ref-type="bibr" rid="B71">Xu <italic>et al.</italic>, 2014</xref>.
Es importante mencionar que Bt no es el responsable de la muerte del insecto per se, sino que una vez que ocurre daño en el intestino del insecto, diversas bac- terias del intestino pasan a la hemolinfa, y finalmente el insecto muere por septice- mia. Este mecanismo de acción ha sido descrito en lepidópteros, y en otros órdenes como coleópteros, nemátodos y dípteros el mecanismo no ha sido elucidado en su totalidad (Vachon et al., 2012). Los factores clave para este evento son la presencia de proteasas específicas, un ambiente alcalino y la presencia de receptores especí- ficos en el intestino del insecto, lo cual explica que las toxinas solo son efectivas en un pequeño rango de hospedadores y, por lo tanto, a menudo tienen un efecto limitado en poblaciones no objetivo (Cawoy et al., 2011). Además, los genes que codifican las proteínas Cry/Cyt se activan durante la esporulación porque están controlados por una ARN polimerasa que también se sintetiza específicamente mientras se forman las esporas (Sanahuja et al., 2011).
A pesar de la diversidad de secuencias de aminoácidos, todas las proteínas Cry comparten una estructura terciaria general similar, como se ha observado en las seis estructuras resueltas hasta ahora mediante cristalografía de rayos X (Cry1Aa, Cry2Aa, Cry3Aa, Cry3Bb, Cry4Aa y Cry4Ba); la porción C-terminal está invo- lucrada en la formación de cristales, pero no es parte de la toxina madura, ya que gran parte de esta se escinde en el intestino del insecto; la porción N-terminal es la toxina misma, y comprende tres dominios: el dominio I es un conjunto de siete hélices α, seis de las cuales son anfipáticas y rodean a la séptima hélice hidrofóbica, este dominio es responsable de la inserción de la membrana y la formación de po- ros líticos; el dominio II consta de tres hojas β antiparalelas con regiones de bucle expuestas; el dominio III es un β-sándwich (Figura 2); los dominios I y II confieren especificidad de unión al receptor, lo que ayuda a definir el rango de hospederos (Boonserm et al., 2006). Por otra parte, las proteínas Cyt se unen directamente a la bicapa lipídica de las células intestinales y están conformadas por un solo dominio compuesto por una hoja β rodeada por dos hélices α (Cohen et al., 2008, 2011).
Existen diversas investigaciones donde se ha reportado el potencial de las proteínas Cry para el control de plagas de importancia agrícola. Niedmann y Meza- Basso (2006), demostraron el potencial de Bt para el control de la polilla del tomate (Tuta absoluta), destacando que en ensayos en hojas de tomate adicionadas con concentrados de proteínas Cry extraídas de las cepas LM-11, LM-12, LM-14 y LM-33 de Bt, se logró la mortalidad entre un 20 y 60% de las larvas de T. abso- luta. También, se han reportado investigaciones donde extractos de proteínas Cry obtenidos de las cepas LBIT-13, LBIT-44, LBIT-383, LBIT-418 y LBIT-428 de Bt, demostraron tener un efecto tóxico en el gusano cogollero del maíz (Spodoptera frugiperda) (Vázquez-Ramírez et al., 2015).
El uso de Bt no se limita al control de plagas agrícolas, ya que su serovariedad B. thuringiensis subsp. israelensis (Bti) descubierta por Goldberg y Margalit (1977) en el desierto de Negev, en Israel, ha sido utilizada y comercializada por su alta actividad para el control de mosquitos y otros dípteros de importancia médica. Bti sintetiza tres proteínas Cry (Cry4A, Cry4B y Cry11A) y una proteína Cyt (Cyt1A), a dicho conjunto se le atribuye la alta toxicidad de Bti, así como la carencia de re- portes de generación de resistencia en insectos susceptibles (da Silva Carvalho et al., 2018).
Las proteínas insecticidas vegetativas (Vip por sus siglas en inglés) son otras proteínas interesantes derivadas de Bt, las cuales son producidas durante la etapa vegetativa de esta bacteria. Incluyen la toxina binaria Vip1 y Vip2 con especificidad contra coleópteros y Vip3 con un amplio espectro de actividad contra lepidópteros. Se ha demostrado el potencial insecticida de Vip1/Vip2 sobre diferentes plagas como el coleóptero Sitophilus zeamais, conocido como la plaga de granos almacenados, y de Vip3 contra las larvas de lepidópteros, Spodoptera frugiperda y Helicoverpa zea, así como contra el gusano bellotero del algodón, Helicoverpa armigera (Mnif y Ghribi, 2015).
Otras toxinas insecticidas menos estudiadas de Bt incluyen las proteínas insec- ticidas secretadas (Sip, por sus siglas en inglés), las cuales son proteínas de aproxi- madamente 41 kDa con actividad reportada contra coleópteros, y las β-exotoxinas. Estas, al igual que las proteínas Sip, son secretadas durante la fase vegetativa, no obstante, las β-exotoxinas son metabolitos secundarios secretadas sólo por ciertas cepas de Bt. Su efecto tóxico no se limita a invertebrados, llegando a ser toxicas con- tra mamíferos, por lo cual el uso de cepas de Bt capaces de sintetizar β-exotoxinas es restringido en diversas partes de América y Europa (Chattopadhyay y Banerjee, 2018; Liu et al., 2014; Palma et al., 2014).
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<italic>Bacillus</italic> COMO BIOFUNGICIDAS</bold>
Los biofungicidas en general pueden definirse como microorganismos o com- puestos naturales que tienen la capacidad de controlar patógenos causantes de las enfermedades en las plantas (Abbey et al., 2019). Existen múltiples reportes res- pecto al modo de acción de los diversos agentes biofungicidas:
Competencia, en que el agente biofungicida compite por factores nutricionales (como nitrógeno o carbono) con hongos, limitando el crecimiento de estos.
Antibiosis, en que existe interacciones biológicas antagónicas entre organismos.
Parasitismo, simbiosis en la cual uno de los organismos subsiste del otro causándole deterioro.
Inducción de resistencia, mecanismo en el cual se induce a la planta adoptar medi- das biológicas que evitan la propagación de patógenos (García-Montelongo et al., 2023; Köhl et al., 2019).
Los fungicidas formulados a base de cepas del género Bacillus ofrecen varias ventajas sobre otros microorganismos, ya que forman endosporas y pueden tole- rar condiciones extremas de pH, temperatura y osmóticas, pudiendo colonizar la superficie de la raíz, aumentan el crecimiento de las plantas y causan la lisis del micelio fúngico (El-Bendary et al., 2016).
<italic>Bacillus subtilis</italic>
Bacillus subtilis ha sido una de las especies más estudiadas y utilizadas por su producción de sustancias con un alto potencial de control biológico, como lo son los compuestos orgánicos volátiles, así como metabolitos secundarios bioactivos (Andrić et al., 2020). Entre estas sustancias resaltan los lantibióticos, son péptidos de bajo peso molecular. Son antibióticos con un alto grado de actividad bactericida contra bacterias Gram positivas, siendo la subtilina el más estudiado en el caso de B. subtilis. Esta forma poros dependientes de voltaje en la membrana citoplásmica de bacterias susceptibles (Klein y Entian, 1994). Otros lantibióticos sintetizados por B. subtilis incluyen la plantazolicina, con alta selectividad contra B. anthracis y la ericina (Molohon et al., 2016; Stein et al., 2002). Existen diversos antibióticos sintetizados por B. subtilis, como lo son: bacitracina, la cual tiene actividad princi- palmente contra bacterias Gram positivas inhibiendo la síntesis de peptidoglicano; bacilisina, la cual cuenta con actividad contra bacterias y hongos, inhibe la síntesis de glucosamina, perturbando la formación de la pared celular microbiana; rizocticina, antibiótico con actividad principalmente contra hongos al inhibir la treonina sintasa, afectando la síntesis de proteínas en hongos susceptibles (Borisova et al., 2010; Molohon et al., 2016; Rajavel et al., 2009; Stein et al., 2002).
Entre el repertorio de proteínas de interés de B. subtilis también se encuentran las fengicidas e iturinas, las cuales tienen un efecto inhibitorio del crecimiento fúngico y actividad antagónica con la membrana celular de hongos (Caulier et al., 2019). Otras sustancias sintetizadas por B. subtilis con actividad contra patógenos de plantas son los lipopéptidos, compuestos de bajo peso molecular con caracterís- ticas anfifílicas que proporciona protección a las plantas, al suprimir directamente el crecimiento de los agentes patógenos o induciendo resistencia sistémica en plan- tas hospederas (Hashem et al., 2019). Cabe resaltar que las sustancias sintetizadas por B. subtilis no solo tienen actividad por sí mismas, también tienen la facultad de inducir una reacción inmune en plantas, volviéndolas menos susceptibles contra infecciones (Andrić et al., 2020).
Las bacterias de la especie Bacillus subtilis son ampliamente estudiadas para el control biológico de microorganismos fitopatógenos, lo que facilita su uso racional; de esta manera, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (USFDA) ha otorgado el estado “generalmente considerado como seguro” (GRAS, por sus siglas en inglés) a esta especie, siendo así, reconocido como no pa- tógeno (Cawoy et al., 2011). B. subtilis es una especie bacteriana ubicua en varios hábitats y cumple diversos nichos ecológicos. No tiene historial de patogenicidad por contacto en el ambiente, la cual ha mostrado ser un potencial agente de con- trol biológico de hongos fitopatógenos y bacterias, mosquitos y nemátodos dañinos (Mnif y Ghribi, 2015; Ongena y Jacques, 2008). La supervivencia de B. subtilis en la rizósfera y, por lo tanto, su alta eficacia como biopesticida es debido a su diversi- dad metabólica (enzimas líticas y compuestos antimicrobianos) y su capacidad para producir esporas (Cawoy et al., 2011).
En diversos estudios se ha reportado el potencial larvicida de metabolitos (li- popéptidos) derivados de B. subtilis, los cuales se han empleado en formulaciones efectivas para el control de Drosophila melanogaster, los dípteros Culex quinque- fasciatus, Anopheles stephensi y Aedes aegypti, así como los lepidópteros Prays oleae, Spodoptera littoralis y Ephestia kuehniella (Mnif y Ghribi, 2015). Geetha y Manonmani (2008), reportaron que las etapas pupales de A. stephensi, C. quinque- fasciatus y A. aegypti [LC50: 2, 7.3 y 11.8 mg mL-1, respectivamente] resultaron ser más susceptibles al lipopéptido mosquitocida que etapas larvarias [LC50: 19, 23 y 34 mg mL-1, respectivamente]; un aspecto notable de estos compuestos insecticidas es el reporte de su estabilidad y que conservan su capacidad larvicida, pupicida y adulticida bajo condiciones como pH extremo, altas temperaturas, radiación solar/ UV, así como a la acción de proteasas (Geetha y Manonmani, 2010; Ghribi et al., 2012).
Por otra parte, se han reportado otras especies del género Bacillus con capacidad de control biológico. Por ejemplo, Bacillus cereus es una bacteria formadora de esporas, ampliamente distribuida en el suelo y utilizada como ACB. B. cereus es un patógeno facultativo natural del mosquito A. aegypti, el principal vector de chikun- gunya y dengue, ya que pueden colonizar los intestinos de las larvas del insecto. La actividad insecticida de B. cereus contra larvas de A. aegypti fue aproximadamente de un 90%, siendo la concentración letal (LC50) de 2.5 ± 0.71 mg mL-1 (Radhika et al., 2011). Además, nuevas especies de este género y con capacidades metabó- licas interesantes podrían conducir a potenciales bioproductos antagonistas a fito- patógenos. B. cabrialesii es una nueva especie de Bacillus, caracterizada como endófita del cultivo de trigo, si bien ésta cepa ha mostrado biocontrol a Bipolaris sorokiniana, sus estrategias como promotora del crecimiento vegetal (solubilizado- ra de fósforo, productora de indoles, incremento de clorofila) podrían volver más interesante su aplicación, para disminuir la aplicación no sólo de pesticidas sinté- ticos, aunado a ello las dosis de fertilización (de los Santos-Villalobos et al., 2018; Valenzuela-Aragón et al., 2019; Villa-Rodríguez et al., 2019).
<bold>USO COMERCIAL DE <italic>Bacillus</italic>
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Los plaguicidas microbianos ofrecen ventajas frente a otros grupos de plaguici- das, incluidos los derivados de hongos y plantas y zooides, debido a que en general los organismos utilizados en los insecticidas microbianos son esencialmente no tóxicos y no patógenos para la vida silvestre, los seres humanos y otros organis- mos no estrechamente relacionados con la plaga objetivo. Además, no dañan al medio ambiente y la calidad del agua y ofrecen una alternativa más eco-amigable que los plaguicidas químicos (Chandler et al., 2011; Sarwar, 2015). Por otra parte, la mayoría de los insecticidas microbianos pueden usarse junto con insecticidas químicos sintéticos porque en la mayoría de los casos el producto microbiano no se desactiva o daña por efecto de los insecticidas convencionales (Mnif y Ghribi, 2015). Asimismo, pueden tener un efecto dual en los cultivos ya que la mayoría de los ACB poseen otros mecanismos, que mejoran la adquisición de nutrientes y/o el desarrollo de la planta, así como las propiedades del suelo, así como tam- bién muestran la capacidad de estimular la defensa y otros procesos fisiológicos de las plantas, que pueden hacer que los cultivos tratados sean más resistentes a una variedad de estrés bióticos y abióticos (Borriss, 2011; Sarwar, 2015). Además, los bioplaguicidas pueden usarse cuando las plagas hayan desarrollado resistencia a los pesticidas convencionales.
Un organismo debe cumplir varios requisitos antes de ser liberado al ambiente como potencial bioplaguicida, entre ellos destaca que i) debe ser altamente especí- fico y efectivo contra la plaga objetivo, ii) demostrar el potencial para ser procesa- do con éxito mediante tecnología de producción continua, iii) estar disponible en formulaciones con una vida útil razonable, iv) mostrar estabilidad y ser inofensivo para el ser humano, la flora y fauna no objetivo (Menéndez y Paço, 2020). El género Bacillus ha sido utilizado como modelo de estudio para la agro-biotecnología por poseer distintas características (Figura 3).
Características de interés de <italic>Bacillus</italic> spp. para la formulación de bioinoculantes.
Por ejemplo, Bacillus thuringiensis (Bt) se ha utilizado como bioplaguicida en la agricultura, la silvicultura y el control de vectores de enfermedades humanas. Sus ventajas son la toxicidad específica contra los insectos objetivo, la falta de resi- duos contaminantes y la seguridad para los organismos no objetivo, como mamífe- ros, aves, anfibios y reptiles (Sansinenea, 2012). Actualmente, los productos a base de B. thuringiensis representan más del 70% de los bioplaguicidas comercializados mundialmente (Figura 4) (Valenzuela Ruiz et al., 2024). La mayoría de las formu- laciones de Bt se obtienen de diferentes cepas, incluyendo B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk) cepa HD1 (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y Cry2Aa); B. thuringiensis subsp. kurstaki (Btk) cepa HD73 (Cry1Ac); B. thuringiensis subsp. aizawai cepa HD137 (Cry1Aa, Cry1B, Cry1Ca, y Cry1Da); B. thuringiensis subsp. tenebrionis (Cry3Aa) y B. thuringiensis subsp. israelensis (Cry4A, Cry4B, Cry11A y Cyt1A) (Mnif y Ghribi, 2015). En México, la aplicación de formulados a base de Bt repre- senta una alternativa eficaz para el control de insectos, presentando un porcentaje de uso de 4 a 10% del total de insecticidas utilizados para los cultivos de maíz, algodón y hortalizas (Tamez Guerra et al., 2001). Además, otras especies del género de Bacillus, tales como: B. subtilis, B. cereus y B. licheniformis, también han demostrado su potencial insecticida control plagas de cultivos agrícolas y vectores de enfermedades humanas (Villarreal-Delgado et al., 2018).
Evolución del género <italic>Bacillus</italic> como bioplaguicida en la industria.
En los últimos años, el mercado de la producción de plaguicidas químicos ha declinado un 2% anual, mientras que la producción de bioplaguicidas presenta un incremento anual del 20% (Cheng et al., 2020). Entre las razones para el interés creciente en los bioplaguicidas, se encuentra la baja probabilidad de que los orga- nismos patógenos desarrollen resistencia, la disminución en el descubrimiento de nuevos insecticidas, una mayor conciencia pública sobre los riesgos de los pla- guicidas sintéticos, el incremento de estudios sobre la especificidad de los biopla- guicidas, avances en la producción y la tecnología de formulación y divulgación, así como una mejor interacción con los productores y las autoridades reguladoras (Olson et al., 2013; Olson, 2015).
Es importante destacar que la transición e integración de los bioplaguicidas en las prácticas agrícolas actuales deben cumplir con ciertos requisitos: a) efectividad contra la plaga o enfermedad, b) compatibilidad con otros métodos de control, c) bajo o nulo impacto ambiental, d) efecto duradero en el entorno, e) rentabilidad desde el punto de vista costo/beneficio, f) viabilidad técnica de su uso, y g) acepta- ción por parte de los productores y la sociedad en general. Por lo tanto, su uso pre- senta una oportunidad para impulsar el desarrollo y modernización de las prácticas agrícolas actuales, contribuyendo a la seguridad alimentaria mediante enfoques de bioseguridad (Villarreal-Delgado et al., 2018).
<bold>Retos actuales y futuros del uso del género B<italic>acillus</italic> en la agricultura</bold>
Existen cuestiones claves para mejorar la eficacia de los bioplaguicidas y la consistencia de la protección, entre ellos destaca la correcta selección de cepas, ya que el método que más se utiliza actualmente es el cribado in vitro, debido a que es fácil de implementar. Este presenta el inconveniente de que generalmente no se toman en cuenta las condiciones ambientales de donde se utilizará, por lo cual es necesario optimizar el proceso de selección, utilizando métodos más realistas que incluyan la vinculación de observaciones en campo con parámetros comprobables (Cawoy et al., 2011).
Otro aspecto que se debe considerar para mejorar la eficacia de los bioplaguici- das, es el agro-sistema, es decir, encontrar combinaciones adecuadas entre biopla- guicidas, plaguicidas químicos, fertilización de plantas, prácticas agrícolas como diferentes tipos de labranza, así como integrarlos en un MIPE que incluya prácticas de cultivo, resistencia de la planta, control químico y otros ACB (Cawoy et al., 2011; Pérez-García et al., 2011; Van Der Heijden et al., 2008). Los métodos de formulación y aplicación también son aspectos claves a considerar que influyen directamente en la eficacia de los bioplaguicidas. Para ello es importante realizar investigaciones sobre sus aplicaciones en ambientes específicos, así como adicio- nar a las formulaciones compuestos u otros microorganismos que sean biocompa- tibles y optimicen la actividad de control biológico (Cawoy et al., 2011; Correa et al., 2009). Asimismo, es necesario estudiar la tolerancia al calor, la desecación, la exposición a la radiación ultravioleta, así como otros tipos de estrés que pudiesen reducir la efectividad de los insecticidas microbianos, en consecuencia, se necesi- tan procedimientos especiales de formulación, aplicación y almacenamiento para algunos plaguicidas microbianos (Chandler et al., 2011).
Por lo tanto, podemos precisar que cada ACB es un organismo particular que efectúa su acción de forma específica, donde los estudios de cada cepa microbiana seleccionada se deben profundizar, con el objetivo de incrementar el conocimiento sobre la forma de potenciar su control biológico mediante una formulación efectiva, considerando aspectos de riesgo ecológico y la bioseguridad para el agro- sistema. Por ello también es necesario profundizar en la correcta identificación del ACB, para descartar el uso de cepas patogénicas para el ser humano. Particular- mente, dentro del grupo de Bacillus cereus, que incluye especies como B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. seudomycoides, B. cytotoxicus y B. weihenstephanensis, algunas cepas hansido identificadas como patógenos para humanos (Villarreal-Delgado et al., 2018).
La virulencia de estas especies se ha asociado principalmente con la presencia de dos toxinas, la hemolisina BL (HBL) y la toxina entérica no hemolítica (NHE), que forman un complejo proteico (Kim et al., 2015). Además, en cepas patógenas se han identificado otras toxinas, incluyendo la citotoxina K (cytK), enterotoxina FM (entFM), enterotoxina S (entS) y enterotoxina T (bceT). También están impli- cados en la patogenicidad de estas cepas productos de otros genes, como la hemo- lisina A (hlyA), hemolisina II y III (hlyI, hlyII), cereolisina A y B (cerA, cerB), y el factor transcripción pleitrópico (pclR) (Ceuppens et al., 2013).
La clasificación y diferenciación de especies dentro del grupo de Bacillus ce- reus se ha realizado utilizando el gen 16S RNAr y otras características como i) virulencia (B. cereus), ii) contenido de plásmidos (B. anthracis y B. thuringiensis), iii) condiciones de crecimiento (B. cytotoxicus y B. weihenstephanensis) y iv) ca- racterísticas morfológicas (B. mycoides y B. seudomycoides). Sin embargo, la dife- renciación entre especies estrechamente relacionadas, como B. cereus, B. anthracis y B. thuringiensis, es limitada cuando se usan factores de virulencia y contenido de plásmidos debido a la pérdida y transferencia de estos elementos a lo largo de su historia evolutiva (Hoffmaster et al., 2006; Liu et al., 2015). Recientemente, es- tudios comparativos de genomas completos utilizando hibridación digital de ADN (dDDH) revelaron una amplia distribución de genes cry y plásmidos tipo pXO en miembros de este grupo. Estos estudios demostraron que hay una baja correlación entre la posición filogenética y la presencia o ausencia de estos plásmidos, además demostraron que el análisis multilocus (MLST) tiene una baja resolución para la diferenciación a nivel de especies (Liu et al., 2015).
Para la selección y comercialización de ACB de estas especies es necesaria su correcta identificación y la determinación de su virulencia para el ser humano. La detección del riesgo potencial de estas especies se puede llevar a cabo mediante estudios de taxonomía, actividad β-hemolítica y detección con marcadores mole- culares de virulencia definidos, pero la única alternativa precisa de clasificar y de- terminar su virulencia es mediante el estudio de genómica comparativa utilizando genomas completos. Sin embargo, es importante considerar que son herramientas costosas, pero a medida que las secuencias de genomas completos se encuentren disponibles se podrán realizar estudios más profundos para garantizar el uso de cepas bioseguras en la agricultura.
Por otra parte, debido a que el uso de bioplaguicidas ha adquirido gran rele- vancia en el sector agrícola, lo cual generalmente implica la aplicación de altas poblaciones del microorganismo de interés con el objetivo de potenciar su esta- blecimiento y colonización, en necesario que se realicen estudios sobre el impacto ecológico de la introducción de un ACB a los agro-sistemas. Esto debido a que bajo ciertas condiciones pudiesen ocasionar cambios en las comunidades microbianas con resultados agro-ecológicamente impredecibles, aún más cuando se inoculan ACB, ya que generalmente su actividad biológica no es específica o selectiva para el agente fitopatógeno en cuestión, lo cual puede generar cambios impredecibles en la estructura microbiana de dichos agro-sistemas (Trabelsi y Mhamdi, 2013). De esta manera, es importante dar seguimiento al impacto de la inoculación de agentes de control biológico sobre la estructura y composición de las comunidades micro- bianas en los agro-sistemas, con el objetivo de garantizar el equilibrio ecológico, además del efecto insecticida buscado.
Agradecimientos
Los autores(as) agradecen al Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) por el financiamiento al Proyecto de Investigación “Los microorganismos nativos del suelo como una estrategia para incrementar la tolerancia a estrés biótico y abiótico en cereales” (11175835959). También agradecen los fondos otorgados por el Instituto Tecnológico de Sonora (PROFAPI_2024_0001), así como a los integrantes del Laboratorio de Biotecnología del Recurso Microbiano (www.itson.mx/LBRM).