rmfiRevista mexicana de fitopatologíaRev. mex. fitopatol0185-33092007-8080Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C.10.18781/R.MEX.FIT.2310-500005Artículos CientíficosDiversidad y taxonomía de Fusarium solani aislado de plantas marchitas de Agave tequilana var azulMontaño-BecerrraViviana1Mancilla-MargalliNorma Alejandra2Chávez-SánchezCristina1Avila-MirandaMartin Eduardo1*Laboratorio de Fitopatología. Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Tlajomulco. Km 10 carretera a San Miguel Cuyutlán, Talajomulco de Zuñiga, Jalisco, México, CP. 45640.Tecnológico Nacional de MéxicoTecnológico Nacional de México45640Mexico Laboratorio de Bioquímica Vegetal. División de Estudios de Posgrado e Investigación. Tecnológico Nacional de México/Instituto Tecnológico de Tlajomulco. Km 10 carretera a San Miguel Cuyutlán, Talajomulco de Zuñiga, Jalisco, México, CP. 45640.Tecnológico Nacional de MéxicoTecnológico Nacional de México45640Mexico*Autor de correspondencia: Martin Eduardo Avila-Miranda martin.am@tlajomulco.tecnm.mx17032025Jan-Apr2025431RMEXFIT231053011202316092024Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative CommonsRESUMEN
Antecedentes/Objetivo.
El objetivo del trabajo fue identificar 24 cepas de F. solani aisladas de agave con marchitez, respecto a las nuevas especies filogenéticas; de- terminar su semejanza molecular con f. spp. de F. solani; determinar su diversidad genética y su capacidad patogénica en agave, frijol (Phaseolus vulgaris) y maíz (Zea mays).
Materiales y Métodos.
Secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de 24 aislados de agave y de las f.spp. de F. solani, se compararon con el GenBank y FUSAROID- ID. Secuencias amplificadas del 18S rRNA, se alinearon con secuencias reportadas de F. solani f. spp. phaseoli y batatas, definiendo presencia de intrones. Se deter- minó diversidad genética con el marcador de DNA RepPCR. Cepas representativas se confrontaron con plántulas de agave, frijol y maíz, evaluando su patogenicidad como severidad de pudrición radicular.
Resultados.
Aislados morfológicamente identificados como F. solani, el GenBank los ubicó como F. solani o incluidos en el FSSC, tres cepas se identificaron como Xenoacremonium sp. FUSAROID-ID definió que las secuencias de F. solani eran altamente similares a las de Neocosmospora martii, N. pseudoradicicola, N. solani y N. falciformis. Las secuencias ITS1-5.8S-ITS2 y ausencia de intrones en su SSU, indicó que ninguno es F. solani f.sp. phaseoli. Aislados obtenidos de agave fueron patogénicos a A. tequilana y a un cv de maíz criollo, pero no a maíces con resisten- cia a Fusarium. Ningún aislado de agave fue patogénico a frijol.
Conclusiones.
Cuatro especies filogenéticas del FSSC provocan pudrición radi- cular en agave; aislados de F. solani de agave no afectaron a maíces resistentes a Fusarium. Es seguro intercalar frijol en el cultivo de agave.
El tequila es considerado la bebida alcohólica mexicana por excelencia. En 2022, se utilizaron 2.61 millones de toneladas de “piñas” de agave tequilero (Agave tequilana var. azul), su materia prima imprescindible, alcanzándose un volumen histórico de producción de 651 millones de litros de tequila, de los cuales el 64% fue exportado (CRT, 2023). El cultivo requiere seis años para madurar y en ese lapso es susceptible a la marchitez del agave, enfermedad en la que Fusarium oxysporum provoca una marchitez vascular o Fusarium solani induce una pudrición radicular, letales a la madurez, reducen drásticamente la producción (Aceves, 2003; Avila-Miranda et al., 2010; Ramírez-Ramírez et al., 2017). F. solani es un hongo necrotrófico, que forma monofialides largas con microconidios apicales no catenulados y macroconidios tipo Fusarium. (Leslie y Summerell 2006; Schroers et al., 2016), pero análisis filogenéticos indicaban que integrantes de esta especie, conformaba el complejo de especies Fusarium solani (FSSC), diverso y sin tipificación específica (Coleman et al., 2009; Nalim et al., 2011; O’Donnell, 2000; O’Donnell et al., 2008; Short et al., 2013; Zhang et al., 2006). Por lo que recientemente, para estabilizar la taxonomía y nomenclatura del FSSC, se reconocieron especies filogenéticas que se incluyeron en el género Neocosmopora (Sandoval-Denis et al., 2019, Crous et al. 2021) o en el género Fusarium (Geiser et al. 2021). Sin embargo, la patogenicidad vegetal del FSSC, continua ambigua, ya que si bien, durante más de 50 años, se han descrito once formas especiales (f. spp.) con capacidad patógena específica a un grupo estrecho de especies hospederas denominadas: phaseoli, pisi, cucurbitae, batatas, radicicola, robiniae, mori, piperis, eumartii, xanthoxyli and glycines (Snyder y Hansen, 1941; McClure, 1951; Sakurai y Matuo, 1959; Sakurai y Matuo, 1961; Matuo y Sakurai, 1965; Roy et al., 1989), pero en 2017 se reportaban más de 1,000 relaciones patogénicas de F. solani, con más de 500 especies de plantas hospederas (Farr y Rossman, 2017).
Como estrategia de manejo de la marchitez del agave cuando incrementa a ni-
veles antieconómicos, se realiza rotación de cultivos, siendo el maíz (Zea mays) el principal cultivo alternante, aunque existe reportes de epidemias severas, aun después de años de rotación. Así mismo, se recomienda sembrar frijol (Phaseolus vulgaris) como cultivo entre hileras en los primeros años, para mejorar el manejo
de maleza y anticipar un beneficio económico en el largo ciclo del agave (HerreraPérez, 2017). Considerando la escasa información de F. solani como fitopatógeno del agave tequilero, este estudio tuvo como objetivos: Definir la taxonomía de 24 cepas identificadas morfológicamente como F. solani, obtenidas de plantas de agave tequilero con marchitez y síntomas de pudrición de raíz y corona, secuenciando el fragmento conservado del ADNr ITS1-5.8S-ITS2 y comparando estas secuencias en la base de datos FUSAROID-ID para ubicarlas taxonómicamente considerando su similitud de secuencias con las nuevas especies filogenéticas reportadas a partir de complejo de especies Fusarium solani (FSSC); con estas mismas secuencias, se buscó relacionar 24 cepas de agave, con las11 f. spp. de F. solani, y definir con base a la presencia de intrones en la subunidad 18S del ADNr (SSU), su similitud molecular con la f. sp. phaseoli que es patogénica a frijol. Adicionalmente, se buscó definir la diversidad genética del genoma completo, utilizando huellas génicas de amplificación de fragmentos repetidos Rep-PCR y a partir del análisis de su diversidad, determinar la capacidad patogénica de cepas representativas, sobre plantas de agave, maíz y frijol, para constatar o definir su condición de hospederos.
Materiales y MétodosMuestreo de plantas de Agave con síntomas
Se muestrearon campos comerciales de nueve municipios de Jalisco, México y un campo cultivado de A. americana con síntomas similares en Comitán, Chiapas, México. Los muestreos estaban encaminados a obtener plantas de agave tequilero con síntomas de marchitez y necrosis rojiza en la base del tallo y corona Figura 1 A y B), con la finalidad de obtener aislamientos de Fusarium solani.
Apariencia de las plantas de las que se obtuvieron los aislados <italic>Fusarium solani</italic> A) Planta de <italic>Agave tequilana</italic> var. azul, con síntomas de marchitez del agave. B) Tejido necrótico rojizo típico en la corona y base del tallo.
Se obtuvieron fragmentos de tejido interno sano, contiguo a tejido necrótico de la base del tallo o la corona (Figura 1B). Los fragmentos se desinfectaron en una mezcla cloro, alcohol y agua estéril (1:1:8, v/v/v) por 1.5 min. y se sembraron en placas de Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar (PDA) incubando a 28 ºC por siete días. Se seleccionaron hongos con conidióforos largos con un solo microconidio en el ápice, preferentemente con macroconidios tipo Fusarium (Figura 2 A y B) (Booth, 1971; Leslie y Summerell, 2006).
Microfotografía de las principales características morfológicas usadas para identificar aislados de <italic>Fusarium solani</italic> obtenidos de tejido necrótico en corona o base del tallo de plantas de <italic>Agave tequilana</italic> var. azul. A). Conidioforos largos con solo un microconidio. B) Macroconidios tipo <italic>Fusarium</italic>.
Para generar micelio, los aislados se sembraron sobre círculos de celofán dulce estéril, colocado sobre PDA, incubando diez días a 27 °C. El micelio se criofracturó en nitrógeno líquido, extrayéndole el ADN utilizando el protocolo de Zymo Research Plant/Seed DNA MiniPrep®, Cat. No. D6020. Su integridad y pureza se corroboró por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% teñido con SYBER® safe Invitrogen DNA gel stain, evidenciada con un transiluminador de luz azul Dark Reader®.
Utilización de marcadores moleculares de ADN
Como marcadores moleculares de ADN se utilizaron: El fragmento ITS1-5.8SITS2, que se obtuvo con los iniciadores ITS1 (5’-TCCTCCGCTTATYGATATGC-3’) e ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), y la subunidad pequeña del ADNr (SSU) amplificando con los iniciadores NS1 (5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’) e ITS2 (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) (White et al., 1990). La
reacción de PCR se llevó a cabo en un cóctel de 50 µL que contenía: 30 µL de agua
desionizada, 10 µL de buffer de reacción 5X MyFi® (1 mM de dNTPs y 3 mM de MgCl2), 2 µL (1 µL por cada iniciador a 20 µM), 2 µL de MyFi® ADN polymerasa Bioline™ y 6 µL del ADN templado. La amplificación se realizó en un termociclador Gradient Palm (Corbett Life Sciences™) con el programa de amplificación siguiente: Una desnaturalización inicial a 95 ºC por 2 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 ºC durante 1 min, anillamiento a 61 ºC durante 2 min y extensión a 72 ºC durante 2 min y una extensión final a 72 ºC por 6 min. Las amplificaciones se evidenciaron en gel de agarosa al 1% teñido con SYBER®safe y foto documentando con una cámara Canon Powershot A620. El tamaño de los amplificados se determinó comparándolos con el marcador de ADN HyperLadder 100bp plus de Bioline®. Los fragmentos amplificados se secuenciaron en el Laboratorio Nacional de Genómica para la Biodiversidad del CINVESTAV (Irapuato, Guanajuato, México). Para definir la ubicación taxonómica molecular de las cepas, el fragmento ITS1-
5.8S-ITS2 de cada cepa, se comparó con la colección de nucleótidos (nr/nt) del GenBank, obteniendo reportes de secuencias altamente semejantes con la herramienta Mega BLAST. Adicionalmente, se obtuvieron las secuencias de este mismo fragmento, que fueron agregadas al GenBank por O’Donnell et al. (2008), Lombard et al. (2015), Rupe et al. (2001), Suga et al. (2000b) y Zaccardelli et al. (2008) de las 11 f. spp. de F. solani reportadas a la fecha: batatas, cucurbitae, eumartii, glycines, mori, phaseoli, piperis, pisi, radicicola, robiniae y xanthoxyli. Todas las secuencias mencionadas, se compararon en la base de datos FUSARIOID-ID (https:// www.fusarium.org/page/Pairwise%20ID) para asociarlas a especies filogenéticas definidas a partir del FSSC (Crous et al., 2021). Con el programa Mega 11, se obtuvo un árbol filogenético agrupado por el método UPMGA, definiendo su distancia evolutiva por el método de Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2021). Para analizar el fragmento SN5-SN8 incluido en la secuencia de la SSU de las cepas aisladas de agave, estas se alinearon con el programa Mega 11 (Tamura et al., 2021), alineando con ellas a las secuencias del fragmento SN5-SN8 de tres cepas de la f. sp. phaseoli con los números de acceso en el Gen Bank AF150481, AF150482, AF150483 y de la f. sp. batatas con el número de acceso AF150485 (Suga et al., 2000a). Esta estrategia se realizó con el fin de corroborar en las alineaciones, la presencia de intrones en este fragmento de la SSU en la f. sp. phaseoli, y determinar su ausencia en la f. sp. batatas considerando que este es un rasgo conservado en f. spp. de F. solani, que ayuda a su identificación molecular (Suga et al., 2000a) y de esta forma se podría determinar la presencia de intrones y la longitud del inserto en
pb, en las cepas de F. solani obtenidas de A. tequilana.
Para determinar la diversidad del genoma completo de las cepas, se generaron huellas génicas de fragmentos repetidos con el marcador de ADN Rep-PCR, utilizando los iniciadores 1R (5IIIIC GICGICATCIGGC-3’) y REP 2I(5’ ICGICTTATCIGGCCTAC-3’) (Versalovic et al., 1991) y el protocolo de Rademaker
y de Brujin (1998) para amplificar, con algunas modificaciones. El cóctel de PCR (25 μL) contenía 2.5 µL de buffer10X (500 mM KCl y 100 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 µL de gelatina, 1% de Tritón, 1.5 mg/mL de BSA), 2.5 µL de dNTPs 2 mM,
1.25 µL de MgCl2 1,5 mM, 2 µL de 0.25 µM de cada iniciador, 0.5 µL de 5U de Taq ADN polimerasa Amplificasa® (BioTecMol) y 3 µL del DNA. El programa de amplificación consistió en una desnaturalización a a 95 °C por 6 min, seguida de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 6 min, anillamiento a 40 °C durante 1 min, extensión a 65 °C durante 8 min y una extensión final a 65 °C durante 16 min. Las huellas génicas se evidenciaron en geles de agarosa al 2.1%, con electroforesis a 4 °C, 40V y 40 mA durante 20 h. La diversidad determinó en base a matrices estandarizadas de presencia ̶ ausencia de fragmentos amplificados de diferente número de pb, con relación al marcador de peso molecular HyperLadder100bp plus de Bioline®. Se generó un árbol filogenético de coeficiente de disimilaridad del promedio de distancias Manhatan, mediante el método de Neighbor-Joining, utilizando el programa NTSYSpc versión 2.21 (Rohlf, 2009).
Pruebas de patogenicidad
Con el fin de evaluar la patogenicidad de cepas representantes de la diversidad genética de F. solani, en tres bioensayos independientes, plantas de Agave tequilana; Plántulas de maíz de los híbridos Magno (Aspros®), Ocelote y Faisán (Asgrow®) reportadas como resistentes a pudrición radicular por Fusarium y una variedad tradicional de maíz “Morado”; además de plántulas de frijol “Flor de Mayo”, fueron inoculadas con las cepas FsH, FsC1, FsC7 y FsCA. Adicionalmente se desarrollaron plantas de las tres especies que no fueron inoculadas y se evaluaron como control no inoculado (NI). Las confrontaciones se evaluaron mediante un diseño completamente al azar con cuatro repeticiones. Las plantas se establecieron en invernadero, en macetas con sustrato de turba y suelo arenoso, esterilizado en horno a 100 °C por 24 h. El inoculo de cada cepa se creció en PDA durante 10 días, pregerminando una suspensión de conidios, agitándola en medio sintético mínimo (Okon et al., 1973) a 150 rpm y 28 °C durante 12 h. Se inoculó el sustrato con 4 x 105 conidios/mL, colocando 1 ml de la suspensión en tres puntos equidistantes de la planta, sin herir raíces. La severidad de pudrición radicular se cuantificó como porcentaje de la longitud necrosada internamente, de diez fragmentos de raíz de 10 cm de longitud por planta. Los tratamientos se evaluaron 90 días después de la inoculación (DDI) en plantas de agave y 42 DDI días en plantas de maíz y frijol. El análisis estadístico se realizó con Proc ANOVA y prueba de medias de Duncan a un nivel de significancia de P≤ 0.05 con el programa SAS versión 9.0 (The SAS Institute Inc., Cary, NC).
Resultados y Discusión
Se obtuvieron 24 aislados identificados morfológicamente como F. solani (Cuadro 1). Todos aislados de plantas de agave con marchitez. Las colonias de las cepas FsP1, FsDr y FsCA, tenían un diámetro claramente menor al crecerse en medio PDA después de 5 días (Figura 3 A), en comparación del diámetro alcanzado por el resto de las cepas (Figura 3 B).
Denominación de las cepas de <italic>F. solani</italic> y <italic>Xenoacremonium</italic> spp. y la ubicación de los campos comerciales de <italic>Agave tequilana</italic> var azul, de donde se obtuvieron los aislados de <italic>Fusarium solani,</italic> ordenada por municipio y zona productora en Jalisco, México.
Altos Sur Ciénega Altos Sur Ciénaga Sierra de Amula Valles
FsDr
San Gabriel, Jal.
Sur
FsCR, FsM, FsI
Teuchitlán, Jal.
Valles
FsA3, FsCA, FsC1, FsD2, FsM1, FsSub, F3
Zapotlanejo, Jal.
Centro
Apariencia de colonias fúngicas después de cinco días de crecimiento en PDA a 28 °C. A) Cepa FsDr molecularmente identificada como <italic>Xenoacremonium</italic> sp. y B) Cepa FsP de <italic>Fusarium solani</italic>. C) Microfotografía de micelio y conidióforos de la cepa FsDr con ausencia de macroconidios.
Se secuenció el fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los aislados obtenidos de plantas de Agave tequilana y estas secuencias se integraron a la base datos del GenBank con las claves de acceso: FsCR MK027255; FsP2 MK027256; FsC1 MK027257;
MK027287; XCA MK027288; XDr MK027289. Al compararse estas secuencias con la colección de nucleótidos (nr/nt), se ratificó molecularmente la taxonomía de 21 aislados como F. solani e integrantes del FSSC, por coincidir con entre 47 y 242 reportes de secuencias altamente similares. Las cepas FsCA, FsDr y FsP1, con los mismos criterios de búsqueda, no fueron altamente similares con F. solani o el FSSC, en cambio sí lo fueron con el género Xenoacremonium, con 15 reportes y 17 de alta similaridad con Xenoacremonium falcatum y X. recifei, que aunado a las características morfológicas antes descritas y a la descripción de Lombard et al. (2015) se consideró que taxonómicamente no eran F. solani. Cuando el fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los asilados identificados como F. solani, se compararon con la base de datos FUSARIOID-ID, se ubicaron taxonómicamente en el género Neocosmospora de acuerdo con las nuevas especies filogenéticas (Sandoval-Denis et al., 2019; Geiser et al., 2021). Por lo que las 21 cepas de F. solani, se subdividieron en: Neocosmospora falciformis (syn de Fusarium falciforme) FsM1, FsP, FsD2, FsI, FsA3 y FsC1; N. solani (syn de F. solani) FsP4, FsF3; N. martii (syn de F. martii) FsQ, FsP2, FsC7, FsC, FsCr y N. pseudoradicicola (syn de F. pseudoradicicola) FsK, FsH, FsG, FsF, FsA, FsSub, FsO y FsM. Esta subclasificación taxonómica permitió una mayor definición de su diversidad, a diferencia de solo considerarlas como F. solani. El dendograma de distancia evolutiva generado con las secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de las 21 cepas (Figura 4), evidenció una distancia considerable con la mayoría de las f. spp., con excepción de f. sp. eumartii que se ubicó contigua a las cepas de N. martii y la f. sp. radicicola que se ubicó entre las cepas de N. falciformis. Todas las cepas aisladas de plantas de Agave tequilana estuvieron evolutivamente distantes de la f.sp. phaseoli. Según reportan O’Donnell et al. (2000); Suga et al. (2000b) y Zaccardelli et al. (2008), cepas de distintas f. spp. de F. solani tienden a agruparse cercanas, cuando se analizan filogenéticamente sus secuencias de ITSs y se consideran especies biológica y filogenéticamente distintas (Coleman, 2016). Sin embargo, las cepas obtenidas de agave, no se podrían considerar una forma especial, por ser de cuatro especies filogenéticas distintas, sin especificidad patogénica, ya que a su vez todas comparten al agave tequilero como hospedero, comportándose como necrotróficos de amplio rango de hospederos (Mengiste, 2012).
Se obtuvieron las secuencias de la SSU del DNAr de las 21 cepas de F. solani
y se incluyeron en la base de datos del GenBank con los siguientes números de acceso: FsC1 MK027267; FsA MK027268; FsA3 MK027269; FsH MK027270; FsO MK027271; FsG MK027272; FsF MK027273: FsF3 MK027274; FsD2 MK027275;
Árbol filogenético de historia evolutiva construido con el método UPGMA, de cepas identificadas en GenBank como <italic>Fusarium solani</italic> y clasificadas en la base de datos FUSARIOID-ID como especies filogenéticas de <italic>Neocosmospora</italic>, analizadas utilizando sus secuencias ITS1-5.8S-ITS2 junto con las de once f. spp. de <italic>F. solani</italic>.
Estas secuencias se cortaron de acuerdo con el inicio y final del fragmento NS5-NS8 (Suga et al., 2000a) y al alinear estos fragmentos con las secuencias de la f. spp. phaseoli y batatas, se corroboró que la f. sp. phaseoli en la secuencia AF150481, tiene dos insertos y mide 1,457 pb; la secuencia AF150482 tiene un inserto y una longitud de 1,025 pb y la secuencia AF150483 tiene un inserto y 1048 pb de longitud, mientras la secuencia AF150484 de la f. sp. batatas no tiene insertos y tiene una longitud de 616 pb. Con estas secuencias como referencia se determinó que ninguna de las cepas de Neocosmopora obtenidas de agave, tiene insertos en el fragmento NS5-NS8 y todas tienen una longitud de 616 pb., por
lo que ninguna es similar a la f. sp. phaseoli, lo que respaldaría la sugerencia de intercalar el cultivo de frijol entre las hileras de agave en época de lluvias, o bien hacer rotación con este cultivo, cuando la marchitez del agave haya incrementado su incidencia, reduciendo el riesgo de incrementar el inoculo de Neocosmodpora spp. al haber infectado y colonizado al frijol.
Al analizar las huellas génicas Rep-PCR obtenidas con el genoma completo de las cepas obtenidas de agave, no se aprecia una clara asociación entre sí, de las especies filogenéticas N. falciformis, N. martii, N. solani y N. pseudoradicicola (Figura 5), como la que se apreció con la diversidad mostrada en el dendograma con solo la secuencia ITS1-5.8S-ITS2. Sin embargo, si se consideran cinco grupos a un coeficiente de disimilaridad de 0.30, la mayor parte de las cepas de tres especies filogenéticas se mantienen en un mismo grupo de diversidad genética, pero a su vez, se conformó un grupo de diversidad, conformado con cepas de las cuatro especies filogenéticas, incluidas las cepas de Xenoacremonium. Lo anterior puede explicar que si bien en genes conservados ITSs y Factor de elongación 1α, estas especies filogenéticas son muy similares, su genoma completo tiene un mayor grado de diversidad, pero existe afinidad entre algunas cepas.
Análisis de diversidad de huellas génicas obtenidas con el marcador molecular de ADN Rep-PCR, de cepas de <italic>Fusarium solani</italic> identificadas como cuatro especies filogenéticas de <italic>Neocosmospora</italic> y de <italic>Xenoacremonium</italic> spp. aisladas de plantas de <italic>Agave tequilana</italic> var azul con marchitez del agave.
Al inocularse cuatro cepas representativas de grupos de diversidad y evaluarse su patogenicidad como severidad de tejido necrótico en raíz, se determinó que las cepas FsH, FsC1 y FsC7 inoculadas en agave, provocaron una severidad del 16.35,
15.10 y 14.65% respectivamente, sin diferencia estadísticas entre ellas. Sin embargo,
las plantas inoculadas con la cepa FsCA, no evidenciaron mayor severidad de necrosis en tejido radicular respecto al control no inoculado (Cuadro 2). De esta forma se corrobora la patogenicidad de las cepas FsH, FsC1 y FsC7 en agave, como previamente reportó Ramírez-Ramírez et al. (2017) con la cepa FsG.
Severidad (%) de pudrición radicular in plantas de agave inoculadas con cepas de <italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>, <italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>, <italic>N</italic>. <italic>martii</italic> y <italic>Xenoacremonium</italic> sp. obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
>Cepas de F. solani
Severidad (%)
PRMDz
FsH N. pseudoradicicola
16.35
A
FsC1 N. falciformis
15.10
A
FsC7 N. martii
14.65
A
FsCA Xenoacremonium sp.
8.45
B
NI
8.33
B
Medias seguidas por la misma letra no difieren significativamente (prueba de rango múltiple de Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
Al inocular las cepas FsC7, FsC1 y FsH y FsCA, sobre cuatro variedades de maíz, las cepas FsC7 y FsH, indujeron necrosis más severas en plantas de maíz “Morado”, promediando 9.9 y 8.1% respectivamente. En un segundo nivel de significancia la cepa C1 provoco necrosis radicular de un 4.8 y 4.7% en maíz Magno y “Morado” respectivamente. Sin embargo, las cepas FsH, FsC7 y FsC1, cuando se inocularon en los híbridos Ocelote® y Faisán®, que se comercializan como resistentes a pudrición radicular inducida por Fusarium en maíz, no evidenciaron mayor severidad de pudrición de raíz que el control no inoculado (Cuadro 3). Considerando que aun cuando este bioensayo fue breve, en invernadero y solo incluyó cuatro materiales genéticos de maíz, evidencia que, entre los materiales de maíz evaluados, hay diversidad en susceptibilidad a las cepas de Neocosmospora spp. aisladas de A. tequilana. Esto es importante, si se considera que la rotación con cultivos no hospederos, es una de las estrategias más económicas para manejar fitopatógenos radiculares en campo, buscando reducir con el tiempo su nivel de inoculo en suelo. Pero si esta rotación no se realiza adecuadamente, el inoculo del patógeno no se reduce y la enfermedad y pérdidas del cultivo que se quiere proteger se mantienen o incluso se incrementan, como en la rotación maíz - soya realizada como estrategia de manejo de Fusarium virguliforme (F. solani f. sp. glycines), causante de la muerte súbita en soya (SDS), que al efectuarla por varios ciclos, no redujo la severidad de la enfermedad en soya, debido a que los materiales de maíz utilizados, se evaluaron como susceptibles a la infección por F. virguliforme, aunque esta infección no reducía su producción (Xing and Westphal, 2009).
Severidad (%) de pudrición radicular en cuatro variedades comerciales y un material criollo de maíz (<italic>Zea mays</italic>) inoculadas con las cepas FsH (<italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>), FsC7 (<italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>), FsC1 (<italic>N</italic>. <italic>martii</italic>) y FsCA (<italic>Xenoacremonium</italic> sp.), obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
Cultivar de maíz
Cepa inoculada
Severidad (%)
PRMDz
Morado
FsC7
9.9
A
Morado
FsH
8.1
AB
Magno
FsC1
4.8
BC
Morado
FsC1
4.7
BC
Morado
FsCA
4.2
CD
Magno
FsC7
3.3
CD
Magno
FsH
2.9
CD
Faisán
FsH
2.8
CD
Faisán
FsCA
2.8
CD
Ocelote
FsC7
2.5
CD
Magno
FsCA
1.7
CD
Faisán
FsC7
1.7
CD
Ocelote
FsC1
1.5
CD
Ocelote
FsH
1.4
CD
Faisán
FsC1
1.1
CD
Ocelote
FsCA
1.0
CD
Ocelote
NI
0.7
CD
Morado
NI
0.7
CD
Faisán
NI
0.5
D
Magno
NI
0.5
D
Medias seguidas por la misma letra no difieren significativamente prueba de rango múltiple
de Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
En las plantas de frijol “Flor de Mayo”, la inoculación de las cepas FsC1, FsC7 y FsH, no indujeron más necrosis radicular, que la observada en el tratamiento control no inoculado, ni la cuantificada con la inoculación de la cepa FsCa de Xenoacremonium sp de 0.28 y 0.17% de severidad respectivamente (Cuadro 4).
Severidad (%) de pudrición radicular en plantas de frijol (<italic>Phaseolus vulgare</italic> cv. Flor de mayo) inoculadas con cepas de <italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>, <italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>, <italic>N</italic>. <italic>martii</italic> y <italic>Xenoacremonium</italic> sp., obtenidas de tejido necrótico de la corona en plantas de agave tequilero con marchitez.
Cepa inoculada
Severidad (%)
PRMDz
FsC1 N. falciformis
0.43
A
NI
0.28
AB
FsC7 N. martii
0.21
AB
FsCA Xenoacremonium sp.
0.17
AB
FsH N. pseudoradicicola
0.03
B
Medias seguidas por la misma letra no difieren significativamente prueba de rango múltiple de
Duncan (PRMD) (* ≤ 0.05).
Conclusiones
De plantas de agave tequilero con síntomas de marchitez y necrosis en la base del tallo y corona, se aislaron principalmente cepas identificadas morfológicamente como F. solani.
Al comparar sus secuencias ITS1-5.8S-ITS2 de cepas obtenidas de Agave tequilana, en la base de datos del GenBank, se identificaron molecularmente como Fusarium solani y se incluían en el complejo de especies F. solani (FSSC).
Al comparar estas mismas secuencias con la base de datos FUSAROID-ID se determinó alta similitud con las de las especies filogenéticas Neocosmospora martii, N. pseudoradicicola, N. solani y N. falciformis, que se reportan como sinónimas de Fusarium martii, F. pseudoradicicola, F. solani y F. falciformis, evidenciando su variabilidad genética.
Secuencias del fragmento ITS1-5.8S-ITS2 de los aislados obtenidos de Agave tequilana fueron molecularmente diferentes de las f. spp. de F. solani, excepto de las f. spp. eumartii que es muy similar a N. martii y la f. sp. radicicola que es muy similar N. falciformis. Esta información, adicionada a la ausencia de intrones en la secuencia de la fracción 18S (SSU), soporta que entre las cepas obtenidas de A. tequilana ninguna es de la f. sp. phasioli.
Cepas representativas de Neocosmospora aisladas de A. tequilana, fueron fitopatógenas a agave, a maíz morado y a maces sin resistencia a Fusarium. En cambio, maíces resistentes a Fusarium, no fueron susceptibles
En pruebas de patogenicidad, ninguna de las cepas fue patogénica a las plantas
de frijol inoculadas lo que parece confirmar los hallazgos moleculares al respecto.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Casa Cuervo S.A. de C.V. su apoyo para realizar el muestreo de campo. Parte de este proyecto fue apoyado por el Tecnológico Nacional de México (TecNM) a través del proyecto número 5434.14-P. VMB agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) por su beca de Maestría en Ciencias.
Literatura Citada Aceves, R. J. J. (2003). Prevención y manejo integral de la marchitez delAgave tequilanaWeber var azul en Jalisco. Folleto técnico Núm. 1. Campo Experimental Altos de Jalisco. CIRPAC. INIFAP. Jalisco, México. AcevesR. J. J.2003Prevención y manejo integral de la marchitez del Agave tequilana Weber var azul en JaliscoFolleto técnico Núm. 1. Campo Experimental Altos de Jalisco. CIRPAC. INIFAP. Jalisco, México. Avila-Miranda, M. E. , Zazueta-López, J. G. , Arias-Castro, C. , & Peña-Cabriales, J. J. (2010). Vascular wilt caused byFusarium oxysporumin agave (Agave tequilanaWeber var. azul). Journal of the Professional Association for Cactus Development, 12, 166-180. https://www.jpacd.org/jpacd/article/view/106Avila-MirandaM. E.Zazueta-LópezJ. G.Arias-CastroC.Peña-CabrialesJ. J.2010Vascular wilt caused by Fusarium oxysporum in agave (Agave tequilana Weber var. azul)Journal of the Professional Association for Cactus Development12166180https://www.jpacd.org/jpacd/article/view/106 Booth, C. (1971). The genusFusarium. Kew, Commonwealth Mycological Institute. 237. BoothC.1971The genus FusariumKewCommonwealth Mycological Institute237237 Coleman, J. J. (2016). TheFusarium solanispecies complex: Ubiquitous pathogens of agricultural importance. Molecular Plant Pathology, 17, 146-158. 10.1111/mpp.12289 ColemanJ. J.2016The Fusarium solani species complex: Ubiquitous pathogens of agricultural importanceMolecular Plant Pathology1714615810.1111/mpp.12289 Coleman, J. J. , Rounsley, S. D. , Rodriguez-Carres, M. , et al. (2009). The genome ofNectria haematococca: contribution of supernumerary chromosomes to gene expansion. PLoS Genetics, 5(8), e1000618. 10.1371/journal.pgen.1000618 ColemanJ. J.RounsleyS. D.Rodriguez-CarresM.2009The genome of Nectria haematococca: contribution of supernumerary chromosomes to gene expansionPLoS Genetics58e100061810.1371/journal.pgen.1000618 Crous, P. W. , Lombard, L. , Sandoval-Denis, M. , et al. (2021). Fusarium: more than a node or a foot-shaped basal cell. Studies in Mycology, 98. 10.1016/j.simyco.2021.100116 CrousP. W.LombardL.Sandoval-DenisM.2021Fusarium: more than a node or a foot-shaped basal cellStudies in Mycology9810.1016/j.simyco.2021.100116 Farr, D. F. , & Rossman, A. Y. (2017). Fungal Databases, U.S. National Fungus Collections, ARS, USDA. Verified March 2, 2018. https://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/FarrD. F.RossmanA. Y.2017Fungal Databases, U.S. National Fungus Collections, ARS, USDAhttps://nt.ars-grin.gov/fungaldatabases/ Herrera-Pérez, L. , Valtierra-Pacheco, E. , Ocampo-Fletes, I. , et al. (2017). Prácticas agroecológicas enAgave tequilanaWeber bajo dos sistemas de cultivo en Tequila, Jalisco. Revista Mexicana de Ciencias Agrícolas. Pub. Esp. Núm. 18:3711-3724. Herrera-PérezL.Valtierra-PachecoE.Ocampo-FletesI.2017Prácticas agroecológicas en Agave tequilana Weber bajo dos sistemas de cultivo en Tequila, JaliscoRevista Mexicana de Ciencias AgrícolasPub. Esp. Núm. 18:3711-3724 Leslie, J. F. , & Summerell, B. A. (2006). TheFusariumlaboratory manual. Hoboken, Wiley-Blackwell Publishing. LeslieJ. F.SummerellB. A.2006The Fusarium laboratory manualHobokenWiley-Blackwell Publishing Lombard, L. , et al. (2015). Generic concepts inNectriaceae. Studies in Mycology, 80, 189-245. 10.1016/j.simyco.2014.12.002 LombardL.2015Generic concepts in NectriaceaeStudies in Mycology8018924510.1016/j.simyco.2014.12.002 Matuo, T. , & Sakurai, Y. (1965). Fusarium solanif.robiniaen. f., one of the causal fusaria of the twig blight ofRobinia pseudoacacia. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 36(1), 31-36. https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjphytopath1918/30/1/30_1_31/_article/-char/ja/MatuoT.SakuraiY.1965Fusarium solani f. robiniae n. f., one of the causal fusaria of the twig blight of Robinia pseudoacaciaAnnals of the Phytopathological Society of Japan3613136https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjphytopath1918/30/1/30_1_31/_article/-char/ja/ McClure, T. T. (1951). Fusariumfoot rot of sweet-potato sprouts. Phytopathology, 41, 72-77. https://worldveg.tind.io/record/7653/McClureT. T.1951Fusarium foot rot of sweet-potato sproutsPhytopathology417277https://worldveg.tind.io/record/7653/ Mengiste, T. (2012). Plant Immunity to necrotrophs. Annual Review of Phytopathology, 50, 267-294. 10.1146/annurev-phyto-081211-172955 MengisteT.2012Plant Immunity to necrotrophsAnnual Review of Phytopathology5026729410.1146/annurev-phyto-081211-172955 Nalim, F. A. , Samuels, G. J. , Wijesundera, R. L. , & Geiser, D. M. (2011). New species from theFusarium solanispecies complex derived from perithecia and soil in the old world tropics. Mycologia, 103, 1302-1330. 10.3852/10-307 NalimF. A.SamuelsG. J.WijesunderaR. L.GeiserD. M.2011New species from the Fusarium solani species complex derived from perithecia and soil in the old world tropicsMycologia1031302133010.3852/10-307 O’Donnell, K. (2000). Molecular phylogeny of theNectria haematococca-Fusarium solanispecies complex. Mycologia, 92, 919-938. 10.2307/3761588 O’DonnellK.2000Molecular phylogeny of the Nectria haematococca-Fusarium solani species complexMycologia9291993810.2307/3761588 Okon, Y. , Chet, I. , & Henis, Y. (1973). Effects of lactose, ethanol and cycloheximide on the translocation pattern of radioactive compounds and on sclerotia formation inSclerotium rolfsii. Journal of General Microbiology, 74, 251-258. 10.1099/00221287-74-2-251 OkonY.ChetI.HenisY.1973Effects of lactose, ethanol and cycloheximide on the translocation pattern of radioactive compounds and on sclerotia formation in Sclerotium rolfsiiJournal of General Microbiology7425125810.1099/00221287-74-2-251 Rademaker, J. L. W. , & de Brujin, F. J. (1998). Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprints and computer-assisted pattern analysis. Pp. 151-171.In: Caetano-Anollés G and Gresshoff PM (eds.). DNA markers protocols, applications, and overviews. Wiley-VCH, USA. Pp 364. RademakerJ. L. W.de BrujinF. J.1998Characterization and classification of microbes by rep-PCR genomic fingerprints and computer-assisted pattern analysisPp. 151-171. In: Caetano-Anollés G and Gresshoff PM (eds.). DNA markers protocols, applications, and overviews. Wiley-VCH, USA. Pp 364. Ramírez-Ramírez, M. J. , Mancilla-Margalli, N. A. , Meza-Álvarez, L. , et al. (2017). Epidemiology ofFusariumagave wilt inAgave tequilanaWeber var. Azul. Plant Protection Science, 53, 144-152. 10.17221/142/2016-PPS Ramírez-RamírezM. J.Mancilla-MargalliN. A.Meza-ÁlvarezL.2017Epidemiology of Fusarium agave wilt in Agave tequilana Weber var. AzulPlant Protection Science5314415210.17221/142/2016-PPS Rohlf, F. J. (2009). NTSYSpc: numerical taxonomy system. ver. 2.21c. Exeter Software. Setauket, New York. RohlfF. J.2009NTSYSpc: numerical taxonomy system. ver. 2.21cExeter SoftwareSetauket, New York Roy, K. W. , et al. (1989). Sudden death syndrome of soybean:Fusarium solanias incitant and relation ofHeterodera glycinesto disease severity. Phytopathology, 72, 191-197. 10.1094/phyto-79-191 RoyK. W.1989Sudden death syndrome of soybean: Fusarium solani as incitant and relation of Heterodera glycines to disease severityPhytopathology7219119710.1094/phyto-79-191 Rupe, J. C. , Correll, J. C. , Guerber, J. C. , Becton, C. M. , et al. (2001). Differentiation of the sudden death syndrome pathogen of soybean,Fusarium solanif.sp.glycines, from other isolates ofF. solanibased on cultural morphology, pathogenicity, and mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphism. Canadian Journal of Botany, 79, 829-835. 10.1139/cjb-79-7-829 RupeJ. C.CorrellJ. C.GuerberJ. C.BectonC. M.2001Differentiation of the sudden death syndrome pathogen of soybean, Fusarium solani f.sp. glycines, from other isolates of F. solani based on cultural morphology, pathogenicity, and mitochondrial DNA restriction fragment length polymorphismCanadian Journal of Botany7982983510.1139/cjb-79-7-829 Sakurai, Y. , & Matuo, T. (1959). On the form name and race ofHypomyces solani(Rke. st Berth.) Snyd. et Hans. which is pathogenic to mulberry trees. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 24, 219-223. 10.3186/jjphytopath.24.219 SakuraiY.MatuoT.1959On the form name and race of Hypomyces solani (Rke. st Berth.) Snyd. et Hans. which is pathogenic to mulberry treesAnnals of the Phytopathological Society of Japan2421922310.3186/jjphytopath.24.219 Sakurai, Y. , & Matuo, T. (1961). Taxonomy of the causal fungus of trunk-blight ofXanthoxylum piperitumand heterothallism in this fungus. Annals of the Phytopathological Society of Japan, 26, 112-117. https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjphytopath1918/26/3/26_3_112/_pdfSakuraiY.MatuoT.1961Taxonomy of the causal fungus of trunk-blight of Xanthoxylum piperitum and heterothallism in this fungusAnnals of the Phytopathological Society of Japan26112117https://www.jstage.jst.go.jp/article/jjphytopath1918/26/3/26_3_112/_pdf Sandoval-Denis, M. , Lombard, L. , & Crous, P. W. (2019). Back to the roots: A reappraisal ofNeocosmospora. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi, 43. 10.3767/persoonia.2019.43.04 Sandoval-DenisM.LombardL.CrousP. W.2019Back to the roots: A reappraisal of NeocosmosporaPersoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi4310.3767/persoonia.2019.43.04 Schroers, H. J. , Samuels, G. J. , Zhang, N. , et al. (2016). Epitypification ofFusisporium(Fusarium)solaniand its assignment to a common phylogenetic species in theFusarium solanispecies complex. Mycologia, 108, 806-819. 10.3852/15-255 SchroersH. J.SamuelsG. J.ZhangN.2016Epitypification of Fusisporium (Fusarium) solani and its assignment to a common phylogenetic species in the Fusarium solani species complexMycologia10880681910.3852/15-255 Short, D. P. G. , O’Donnell, K. , et al. (2013). Phylogenetic relationships among members of theFusarium solanispecies complex in human infections and the descriptions ofF. keratoplasticumsp. nov. andF. petroliphilumstat. nov. Fungal Genetics and Biology, 53, 59-70. 10.1016/j.fgb.2013.01.004 ShortD. P. G.O’DonnellK.2013Phylogenetic relationships among members of the Fusarium solani species complex in human infections and the descriptions of F. keratoplasticum sp. nov. and F. petroliphilum stat. novFungal Genetics and Biology53597010.1016/j.fgb.2013.01.004 Snyder, W. C. , & Hansen, H. N. (1941). The species concept inFusariumwith reference to section Martiella. American Journal of Botany, 28, 738-742. 10.2307/2436658 SnyderW. C.HansenH. N.1941The species concept in Fusarium with reference to section MartiellaAmerican Journal of Botany2873874210.2307/2436658 Suga, H. , et al. (2000). Phylogenetic analysis of the phytopathogenic fungusFusarium solanibased on the rDNA-ITS region. Mycological Research, 104, 1175-1183. 10.1017/S0953756200002719 SugaH.2000Phylogenetic analysis of the phytopathogenic fungus Fusarium solani based on the rDNA-ITS regionMycological Research1041175118310.1017/S0953756200002719 Suga, H. , Oyabu, K. , Ito, M. , Kageyama, K. , & Hyakumachi, M. (2000). Detection of intron-like sequences in the small subunit rDNA 3’ region ofFusarium solani. Mycological Research, 104, 782-787. 10.1017/S0953756299002208 SugaH.OyabuK.ItoM.KageyamaK.HyakumachiM.2000Detection of intron-like sequences in the small subunit rDNA 3’ region of Fusarium solaniMycological Research10478278710.1017/S0953756299002208 Tamura, K. , Stecher, G. , & Kumar, S. (2021). MEGA11: Molecular evolutionary genetics analysis. Molecular Biology and Evolution, 38, 3022-3027. 10.1093/molbev/msab120 TamuraK.StecherG.KumarS.2021MEGA11: Molecular evolutionary genetics analysisMolecular Biology and Evolution383022302710.1093/molbev/msab120 Versalovic, J. , Koeuth, T. , & Lupski, J. R. (1991). Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Research, 19, 6823-6831. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC329316/pdf/nar00104-0140.pdfVersalovicJ.KoeuthT.LupskiJ. R.1991Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomesNucleic Acids Research1968236831https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC329316/pdf/nar00104-0140.pdf White, T. J. , Bruns, T. , Lee, S. , & Taylor, J. (1990). Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 315-322. 10.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1 WhiteT. J.BrunsT.LeeS.TaylorJ.1990Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogeneticsPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications31532210.1016/B978-0-12-372180-8.50042-1 Xing, L. , & Westphal, A. (2009). Effects of crop rotation of soybean with corn on severity of sudden death syndrome and population densities ofHeterodera glycinesin naturally infested soil. Field Crops Research, 112, 107-117. 10.1016/j.fcr.2009.02.008 XingL.WestphalA.2009Effects of crop rotation of soybean with corn on severity of sudden death syndrome and population densities of Heterodera glycines in naturally infested soilField Crops Research11210711710.1016/j.fcr.2009.02.008 Zaccardelli, M. , Vitale, S. , et al. (2008). Morphological and molecular characterization ofFusarium solaniisolates. Journal of Phytopathology, 156, 534-541. 10.1111/j.1439-0434.2008.01403.x ZaccardelliM.VitaleS.2008Morphological and molecular characterization of Fusarium solani isolatesJournal of Phytopathology15653454110.1111/j.1439-0434.2008.01403.x Zhang, N. , O’Donnell, K. , et al. (2006). Members of theFusarium solanispecies complex that cause infections in both humans and plants are common in the environment. Journal of Clinical Microbiology, 44, 2185-2190. 10.1128/JCM.00120-06 ZhangN.O’DonnellK.2006Members of the Fusarium solani species complex that cause infections in both humans and plants are common in the environmentJournal of Clinical Microbiology442185219010.1128/JCM.00120-06Scientific ArticleDiversity and taxonomy of Fusarium solani isolated of wilted Agave tequilana var. azul plantsAbstractBackground/Objective.
The objective of this work was to identify 24 strains of F. solani isolated from agave with wilt, with respect to the new phylogenetic species; determine their molecular similarity to F. solani f. spp.; determine their genetic diversity and their pathogenic capacity in agave, bean and corn.
Materials and Methods.
Sequences of the ITS1-5.8S-ITS2 fragment of 24 agave isolates and those of F. solani f.spp., were compared with GenBank and FUSAROID-ID. Amplified 18S rRNA sequences were aligned with sequences reported of F. solani f. spp. phaseoli and batatas, defining the presence of introns. Genetic diversity was determined with the DNA RepPCR marker. Representative strains were tested against agave, bean and maize seedlings, evaluating their pathogenicity as root rot severity.
Results.
Isolates morphologically identified as F. solani, GenBank placed them as
F. solani or included in the FSSC, three strains were identified as Xenoacremonium sp. FUSAROID-ID defined that the sequences of F. solani were highly similar to those of Neocosmospora martii, N. pseudoradicicola, N. solani and N. falciformis. The ITS1-5.8S-ITS2 sequences and absence of introns in its SSU indicated that none is F. solani f. sp. phaseoli. Isolates obtained from agave were pathogenic to
A. tequilana and a criollo corn cv, but not to Fusarium-resistant corn. No agave isolates were pathogenic to beans.
Conclusions.
Four phylogenetic species of FSSC cause root rot in agave; F. solani isolates from agave did not affect Fusarium-resistant corn. It is safe to intercrop beans in agave.
Tequila is considered the quintessential Mexican alcoholic beverage. In 2022, 2.61 million tons of agave (Agave tequilana var. azul) stems “piñas”, its essential raw material, were used, reaching a historical production volume of 651 million liters of tequila, of which 64% was exported (CRT, 2023). The crop requires six years to mature and, in that time, it is susceptible to agave wilt, a disease in which Fusarium oxysporum causes a vascular wilt or Fusarium solani induces a rot in the roots, lethal in maturity, and as such reduce production drastically (Aceves, 2003; Avila-Miranda et al., 2010; Ramírez-Ramírez et al., 2017). F. solani is a necrotrophic fungus, which forms long monophialides with non-catenulated apical microconidia and Fusarium macroconidia (Leslie and Summerell, 2006; Schroers et al., 2016), although phylogenetic analyses indicated that members of that species made up the Fusarium solani species complex (FSSC), diverse and without a specific typification (Coleman et al., 2009; Nalim et al., 2011; O’Donnell, 2000; O’Donnell et al., 2008; Short et al., 2013; Zhang et al., 2006). Therefore, in order to stabilize the taxonomy and nomenclature of the FSSC, phylogenetic species were recently recognized which were included in the genus Neocosmopora (SandovalDenis et al., 2019, Crous et al., 2021) or in the genus Fusarium (Geiser et al., 2021). However, the plant pathogenicity of the FSSC, continues to be ambiguous, since, despite eleven formae speciales (f. spp.) called phaseoli, pisi, cucurbitae, batatas, radicicola, robiniae, mori, piperis, eumartii, xanthoxyli and glycines (Snyder and Hansen, 1941; McClure, 1951; Sakurai and Matuo, 1959; Sakurai and Matuo, 1961; Matuo and Sakurai, 1965; Roy et al., 1989), having been described for over 50 years with a specific pathogenic capacity to a narrow group of species, in 2017, around 1,000 pathogenic relations with F. solani were reported with over 500 species of host plants (Farr and Rossman, 2017).
As a strategy to manage wilt in agave when it increases to anti-economic levels, crop rotation is carried out, with maize (Zea mays) being the main alternating group, although there are reports of severe epidemics, even after years of rotation. Likewise, the planting of beans (Phaseolus vulgaris) is recommended as a crop between rows in the first years to improve weed management and anticipate an economic benefit in the long cycle of the agave (Herrera-Pérez, 2017). Considering the lack of information of F. solani as a phytopathogen of Agave tequilana, the aims of this study were to define the taxonomy of 24 strains identified morphologically as
F. solani, isolated from agave plants with wilt and symptoms of root and crown rot. Conserved fragment of the rRNA ITS-5.8S-ITS2 were sequenced and compared into the FUSAROID-ID data base to locate them taxonomically, considering their similarity of sequences with the new phylogenetic species reported from the Fusarium solani species complex (FSSC). With these same sequences, an attempt was made to relate 24 agave strains with the 11 F. solani f. spp. to define, based on the presence of introns in the 18S rDNA (SSU) subunit, its molecular similarity to f. sp. phaseoli, which is pathogenic to beans. In addition, an attempt was also made to define the genetic diversity of the complete genome, using Rep-PCR fingerprints of repeated fragment amplification, and from the analysis of this diversity, determine the pathogenic capacity of representative strains on agave, maize and bean plants in order to confirm or define their host status.
Materials and MethodsSampling symptomatic agave plants
Nine commercial fields in nine municipal areas in Jalisco, Mexico were sampled, in addition with another field with A. americana with similar symptoms in Comitán, Chiapas, Mexico. The sampling was aimed to obtain agave plants with symptoms of wilt and reddish necrosis in the base of the stem and crown (Figure 1 A and B), in order to obtain Fusarium solani isolations.
Fragments of healthy internal tissue, adjacent to necrotic tissue from the base of the stem or the crown, were obtained (Figure 1B). The fragments were disinfected in a mixture of chlorine, alcohol and sterilized water (1:1:8, v/v/v) for
1.5 min. and planted in Petri dishes with a potato-dextrose-agar (PDA) culture medium, incubated at 28 ºC for seven days. Fungi with long conidiophores with
Appearance of plants from which the <italic>Fusarium solani</italic> strains were isolated A) <italic>Agave tequilana</italic> var. azul plant, with symptoms of agave wilt. B) Typical reddish necrotic tissue in the crown and the base of the stem.
a single microconidium at the apex were selected, preferably with Fusarium-type macroconidia (Figure 2 A and B) (Booth, 1971; Leslie and Summerell, 2006).
To generate mycelia, the isolations were grown on sweet sterile cellophane, placed on PDA and incubated for ten days at 27 °C. The mycelium was cryofractured in liquid nitrogen and the DNA was extracted using the Zymo Research Plant/Seed DNA MiniPrep™ protocol, Cat. No. D6020. Its integrity and purity were confirmed by electrophoresis on a 0.8% agarose gel stained with SYBRSafe™ Invitrogen DNA gel stain, visualized using a Dark Reader™ blue light transilluminator.
Microphotograph of the main morphological characteristics used to identify <italic>Fusarium solani</italic> isolations obtained from necrotic tissue in the crown or base of the stem of <italic>Agave tequilana</italic> var. azul plant. A). Long conidiophores with only one microconidium. B) <italic>Fusarium</italic> macroconidia.
Using DNA molecular markers
The following were used as DNA molecular markers: The fragment ITS1-5.8SITS2, obtained with the primers ITS1 (5’-TCCTCCGCTTATYGATATGC-3’) and ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’), and the small subunit of rDNA (SSU) amplified with the primers NS1 (5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’) and ITS2 (5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’) (White et al., 1990). The PCR reaction was performed in a 50 µL cocktail containing 30 µL of deionized water, 10 µL of 5X MyFi™ buffer reaction (1 mM of dNTPs and 3 mM of MgCl2), 2 µL (1 µL for each primer at 20 µM), 2 µL of MyFi™ Bioline™ polymerase and 6 µL of the DNA template. Amplification was carried out in a Gradient Palm thermocycler (Corbett Life Sciences™) with the following amplification program: An initial denaturation at 95 ºC for 2 min; 30 cycles with denaturation at 94 ºC for 1 min, annealing at 61 ºC for 2 min and an extension at 72 ºC for 2 min and a final extension at 72 ºC
for 6 min. The amplifications were visualized in a 1% agarose gel, stained with SYBERsafe™ and photo-documented with a Canon Powershot™ A620 camera. The size of the amplifications was determined by comparing them with the Bioline™ HyperLadder 100bp plus DNA marker. The amplified fragments were sequenced in the National Laboratory of Genetics of Biodiversity of the CINVESTAV (Irapuato, Guanajuato, Mexico).
To define the molecular taxonomic location of the strains, the ITS1-5.8S-ITS2 fragment of each strain was compared with the nucleotide collection (nr/nt) of the GenBank, and reports were obtained of highly similar sequences with the Mega BLAST tool. In addition, the sequences of this same tool were obtained, which were added to the GenBank by O’Donnell et al. (2008), Lombard et al. (2015), Rupe et al. (2001), Suga et al. (2000b) and Zaccardelli et al. (2008) of the 11 f. spp. of F. solani reported to date: batatas, cucurbitae, eumartii, glycines, mori, phaseoli, piperis, pisi, radicicola, robiniae and xanthoxyli. All these sequences were compared in the FUSARIOID-ID database (https://www.fusarium.org/page/ Pairwise%20ID) to associate them to phylogenetic species defined from the FSSC (Crous et al., 2021). Using the program Mega 11, a phylogenetic tree was obtained grouped with the UPMGA method, defining its evolutionary distance with the Maximum Composite Likelihood method (Tamura et al., 2021).
To analyze the SN5-SN8 fragment included in the SSU sequence of the isolated agave strains, they were aligned using the program Mega 11 (Tamura et al., 2021), thus aligning the sequences of the fragment SN5-SN8 of three f. sp. phaseoli strains with Gen Bank accession numbers AF150481, AF150482, AF150483 and one of the f. sp. batatas with accession number AF150485 (Suga et al., 2000a). This strategy was carried out to verify, in the alignments, the presence of introns in this fragment of the SSU in f. sp. phaseoli, and to determine their absence in f. sp. batatas, considering that this is a trait that remains in f. spp of F. solani, which helps in its molecular identification (Suga et al., 2000a). In this way, the presence of introns and the insert length in base pairs could be determined in the F. solani strains obtained from A. tequilana.
To determine the diversity of the complete genome of the strains, genetic fingerprinting were generated from fragments repeated with the Rep-PCR DNA marker, using primers 1R (5IIIIC GICGICATCIGGC-3’) and REP 2I(5’ ICGICTTATCIGGCCTAC-3’) (Versalovic et al., 1991) and the protocol by Rademaker and Brujin (1998) to amplify, with a few modifications. The PCR cocktail (25 μL) contained 2.5 µL of buffer10X (500 mM KCl and 100 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 µL gelatin, 1% Triton, 1.5 mg/mL BSA), 2.5 µL of 2 mM dNTPs, 1.25 µL of 1.5 mM MgCl2, 2 µL of 0.25 µM of each primer, 0.5 µL of 5U of Taq DNA polymerase Amplificasa™ (BioTecMol) and 3 µL of the DNA. The amplification program consisted in a denaturation at 95 °C for 6 min, followed by 30 cycles with
denaturation at 94 °C for 6 min, annealing at 40 °C for 1 min, an extension at 65
°C for 8 min and a final extension at 65 °C for 16 min. The genetic fingerprinting were visualized in agarose gels at 2.1%, with electrophoresis at 4 °C, 40V and 40 mA for 20 h. Diversity was determined based on standardized matrices of presenceabsence of amplified fragments of different base pair numbers in relation to the HyperLadder100bp plus molecular weight marker from Bioline™. A phylogenetic tree was generated using the Manhattan average dissimilarity coefficient, with the Neighbor-Joining method, using the NTSYSpc program, version 2.21 (Rohlf, 2009).
Pathogenicity tests
In order to evaluate the pathogenicity of representative strains of the genetic diversity of F. solani, in three independent bioassays, Agave tequilana plants; maize seedlings of the Magno (Aspros ™), Ocelote and Faisán hybrids (Asgrow™) reported as resistant to root rot by Fusarium and a traditional variety of “Morado” maize; as well as “Flor de Mayo” bean seedlings were inoculated with the FsH, FsC1, FsC7 and FsCA strains. Additionally, plants of the three species that were not inoculated were developed and evaluated as non-inoculated control (NI). Confrontations were evaluated by a completely randomized design with four repetitions. The plants were established in a greenhouse, in pots with a peat and sandy soil substrate, sterilized in an oven at 100 °C for 24 h. The inoculum of each strain was grown in PDA for 10 days, pre-germinating a conidial suspension by shaking it in a minimal synthetic medium (Okon et al., 1973) at 150 rpm and 28
°C for 12 h. The substrate was inoculated with 4 x 105 conidia/mL, placing 1 mL of the suspension in three equidistant points around the plant, without injuring the roots. The severity of the root rot was quantified as a percentage of the internally necrotic lenght of ten root fragments, each 10 cm long per plant. The treatments were evaluated 90 days after inoculation (DDI) in agave plants and 42 DDI in maize and bean plants. The statistical analysis was carried out with Proc ANOVA and Duncan’s multiple range test at a significance level of P≤ 0.05 with the program SAS, version 9.0 (The SAS Institute Inc., Cary, NC).
Results and Discussion
Twenty-four isolates, morphologically identified as F. solani (Table 1) were obtained. They were all isolated from agave plants with wilt. The cultures of strains FsP1, FsDr and FsCA had a clearly smaller diameter, in PDA medium after 5 days (Figure 3 A), in comparison with the diameter reached by the rest of the strains (Figure 3 B).
Designation of <italic>F</italic>. <italic>solani</italic> and <italic>Xenoacremonium</italic> spp strains and ubication of the commercial <italic>Agave tequilana</italic> var azul fields where strains were obtained by municipality and production zone in Jalisco, Mexico.
Altos Sur Ciénega Altos Sur Ciénaga Sierra de Amula Valles
FsDr
San Gabriel, Jal.
Sur
FsCR, FsM, FsI
Teuchitlán, Jal.
Valles
FsA3, FsCA, FsC1, FsD2, FsM1, FsSub, F3
Zapotlanejo, Jal.
Centro
Appearance of fungal cultures after five days of growing in PDA at 28 °C. A) FsDr strain, identified molecularly as <italic>Xenoacremonium</italic> sp.and B) <italic>Fusarium solani</italic> FsP strain. C) Microphotograph of mycelium and conidiophore of the FsDr strain without macroconidia.
The fragment ITS1-5.8S-ITS2 of the isolations obtained from Agave tequilana plants was sequenced and these sequences were integrated into the GenBank database with accession codes FsCR MK027255; FsP2 MK027256; FsC1 MK027257; FsM MK027258; FsSub MK027259; FsA3 MK027260; FsD2 MK027261; FsM1 MK027262; FsP4 MK027263; FsF3 MK027264; FsA KU878136; FsC KU878137; FsF KU878138; FsG KU878139; FsH KU878140; FsK KU878141; FsO KU878142;:FsP KU878143; FsQ KU878144; FsC7 KU878145; XP1 MK027287; XCA MK027288; XDr MK027289. When comparing
these sequences with the collection of nucleotides (nr/nt), the taxonomy of 21 isolations such as F. solani and members of the FSSC were molecularly ratified, for coinciding with 47 to 242 reports of highly similar sequences. FsCA, FsDr and FsP1 strains, with the same search criteria, were not highly similar to F. solani or
the FSSC, but they were similar to the genus Xenoacremonium, with 15 reports and 17 of high similarity with Xenoacremonium falcatum and X. recifei, which, along with the previously described morphological characteristics and the description by Lombard et al. (2015), was taxonomically not considered to be F. solani. When the fragment ITS1-5.8S-ITS2 of the different isolates of F. solani were compared with the FUSARIOID-ID data base, they were taxonomically located in the genus Neocosmospora according to the new phylogenetic species (Sandoval-Denis et al., 2019; Geiser et al., 2021). Therefore, the 21 F. solani strains were subdivided into Neocosmospora falciformis (syn of Fusarium falciforme) FsM1, FsP, FsD2, FsI, FsA3 and FsC1; N. solani (syn of F. solani) FsP4, FsF3; N. martii (syn of F. martii) FsQ, FsP2, FsC7, FsC, FsCr and N. pseudoradicicola (syn of F. pseudoradicicola) FsK, FsH, FsG, FsF, FsA, FsSub, FsO and FsM. This taxonomic subclassification helped to give a greater definition of its diversity, unlike considering them only
F. solani. The evolutionary distance dendrogram generated with the ITS1-5.8SITS2 fragment sequences of the 21 strains (Figure 4), showed a considerable distance from most of the f. spp., with the exception of f. sp. eumartii, which was located next to the N. martii strains, and the f. sp. radicicola, which was located among the N. falciformis strains. All the strains isolated from Agave tequilana plants were evolutionarily distant from the f.sp. phaseoli. According to reports by O’Donnell et al. (2000); Suga et al. (2000b) and Zaccardelli et al. (2008), strains from different F. solani f. spp. tend to group closely when their ITS sequences are analyzed phylogenetically and are considered biologically and phylogenetically different species (Coleman, 2016). However, the strains taken from agave could not be considered a special form, as they belong to four distinct phylogenetic species without a pathogenic specificity, since they all share tequila agave as a host, behaving as necrotrophic with a wide range of hosts (Mengiste, 2012).
The sequences of the SSU of rDNA of the 21 strains of F. solani were obtained and included in the GenBank data base, with the following accession numbers: FsC1 MK027267; FsA MK027268; FsA3 MK027269; FsH MK027270; FsO MK027271; FsG MK027272; FsF MK027273: FsF3 MK027274; FsD2 MK027275; FsM MK027276; FsM1 MK027277; FsC MK027278; FsC7 MK027279; FsCR MK027280; FsK MK027281; FsQ MK027282; FsP MK027283; FsP2 MK027284; FsP4 MK027285; FsSub MK027286.
These sequences were cut according to the beginning and end of the fragment NS5-NS8 (Suga et al., 2000a), and when aligning these fragments with the sequences of the f. spp. phaseoli and batatas, f. sp. phaseoli in sequence AF150481 was verified to have two inserts and measures 1,457 pb; sequence AF150482 has one insert and a length of 1,025 pb and sequence AF150483 has one insert and a length of 1048 pb, while sequence AF150484 of the f. sp. batatas has no inserts and has a length of 616 pb. With these sequences as a reference, it was determined that
Phylogenetic tree of evolutive history constructed with UPGMA method from strains identified as <italic>Fusarium solani</italic> in the GenBank and classified as phylogenetic species of <italic>Neocosmospora</italic> using FUSARIOID-ID nucleotide base, analyzing ITS1-5.8S-ITS2 sequences comparing with those of eleven <italic>F. solani</italic> f. spp.
none of the Neocosmopora strains isolated from agave have inserts in the fragment NS5-NS8 and all have a length of 616 pb., therefore none are similar to the f. sp. phaseoli, which would support the suggestion of intercropping beans between the rows of agave during the rainy season, or rotating with this crop when the incidence of agave wilt has increased, reducing the risk of increasing the inoculum of Neocosmodpora spp. by infecting and colonizing the beans.
An analysis of the Rep-PCR fingerprints obtained with the complete genome of the strains taken from agave, showed no clear association between the phylogenetic species N. falciformis, N. martii, N. solani and N. pseudoradicicola (Figure 5) as seen with the diversity shown in the dendrogram with only the sequence ITS1-
5.8S-ITS2. Nevertheless, if five groups are considered at a dissimilarity coefficient
of 0.30, most of the strains from three phylogenetic species remain in the same
Diversity analysis of fingerprints obtained with the DNA marker Rep-PCR from strains of <italic>Fusarium solani</italic> identified as four phylogenetic species of <italic>Neocosmospora</italic> and <italic>Xenoacremonium</italic> spp. isolated from <italic>Agave tequilana</italic> var azul with agave wilt.
genetic diversity group. However, a diversity group was also formed, consisting of strains from all the four phylogenetic species, including the Xenoacremonium strains. This may explain that, although in ITSs and 1α elongation factor conserved genes, these phylogenetic species are very similar, their complete genome has a higher degree of diversity, but there is affinity between some strains.
When inoculating four representative strains from diversity groups and evaluating their pathogenicity as the severity of necrotic tissue, it was determined that the FsH, FsC1 and FsC7 strains inoculated in agave led to a severity of 16.35,
15.10 and 14.65 % respectively, without statistical differences between them. However, in the plants inoculated with the FsCA strain, no greater severity of root tissue necrosis was observed compared to the non-inoculated control (Table 2). This corroborates the pathogenicity of the FsH, FsC1 and FsC7 strains in agave, as previously reported by Ramírez-Ramírez et al. (2017) with the FsG strain.
When inoculating the strains FsC7, FsC1 and FsH and FsCA in four maize varieties, strains FsC7 and FsH induced more severe necrosis in “Morado” maize plants, with averages of 9.9 and 8.1% respectively. In a second level of significance, the C1 strain caused root necrosis by 4.8 and 4.7% in Magno and “Morado” maize, respectively. However, the strains FsH, FsC7 and FsC1, when inoculated in the hybrids Ocelote® and Faisán®, which are sold as resistant to root rot induced by Fusarium in maize, displayed no greater root rot severity than the non-inoculated control (Table 3). Considering that, despite this bioassay having been brief, being conducted in a greenhouse and only including four genetic materials in maize, it
Severity (%) of root rot in agave plants inoculated with <italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>, <italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>, <italic>N</italic>. <italic>martii</italic> and <italic>Xenoacremonium</italic> sp. obtained from rotten crown tissue of <italic>Agave tequilana</italic> var azul plants with agave wilt.
F. solani strains
Severity (%)
DMRT z
FsH N. pseudoradicicola
16.35
A
FsC1 N. falciformis
15.10
A
FsC7 N. martii
14.65
A
FsCA Xenoacremonium sp.
8.45
B
NI
8.33
B
Means followed with the same letter are not significatively different. Duncan´s Multiple Rage Test
(DMRT) (* ≤ 0.05).
Severity (%) of root rot in four commercial and one native cultivar of corn (<italic>Zea mays</italic>) inoculated with the strains FsH (<italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>), FsC7 (<italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>), FsC1 (<italic>N</italic>. <italic>martii</italic>) y FsCA (<italic>Xenoacremonium</italic> sp.), obtained from rotten crown of agave plants (<italic>Agave tequilana</italic> Weber var. azul) with agave wilt.
Corn variety
Inoculated strain
Severity (%)
DMRTz
Morado
FsC7
9.9
A
Morado
FsH
8.1
AB
Magno
FsC1
4.8
BC
Morado
FsC1
4.7
BC
Morado
FsCA
4.2
CD
Magno
FsC7
3.3
CD
Magno
FsH
2.9
CD
Faisán
FsH
2.8
CD
Faisán
FsCA
2.8
CD
Ocelote
FsC7
2.5
CD
Magno
FsCA
1.7
CD
Faisán
FsC7
1.7
CD
Ocelote
FsC1
1.5
CD
Ocelote
FsH
1.4
CD
Faisán
FsC1
1.1
CD
Ocelote
FsCA
1.0
CD
Ocelote
NI
0.7
CD
Morado
NI
0.7
CD
Faisán
NI
0.5
D
Magno
NI
0.5
D
Means followed with the same letter are not significatively different. Duncan’s Multiple Rage
Test (DMRT) (* ≤ 0.05).
shows that among the evaluated maize materials, there is diversity in the susceptibility to Neocosmospora spp. strains isolated from A. tequilana. This is important if we consider that the rotation with non-host crops is one of the cheapest strategies to handle soil borne plant pathogens in the field, when attempting to reduce its level of inoculum in the soil. Yet if this rotation is not carried out adequately, the inoculum of the pathogen is not reduced and losses in the crop that is trying to be protected remain or are even increased, such as in the maize-soybean rotation performed as a strategy for the management of Fusarium virguliforme (F. solani f. sp. glycines), causing sudden death in soybean (SDS), which, when performed for several cycles, did not reduce the severity of the disease in soybean, since the maize materials used were evaluated as susceptible to infection by F. virguliforme, although this infection did not reduce its production (Xing and Westphal, 2009).
In the “Flor de Mayo” bean plants, the inoculation of strains FsC1, FsC7 y FsH, did not induce more root necrosis than that observed in the non-inoculated control treatment, nor that quantified with the inoculation of the FsCa strain of Xenoacremonium sp of 0.28 y 0.17% de severity respectively (Table 4).
Severity (%) of root rot in bean (<italic>Phaseolus vulgare</italic> cv. Flor de Mayo) plants inoculated with strains of <italic>Neocosmospora pseudoradicicola</italic>, <italic>N</italic>. <italic>falciformis</italic>, <italic>N</italic>. <italic>martii</italic> y <italic>Xenoacremonium</italic> sp., isolated from rotten crown tissue of <italic>Agave tequilana</italic> var. azul with agave wilt.
Inoculated strain
Severity (%)
DMRTz
FsC1 N. falciformis
0.43
A
NI
0.28
AB
FsC7 N. martii
0.21
AB
FsCA Xenoacremoniumsp.
0.17
AB
FsH N. pseudoradicicola
0.03
B
Means followed with the same letter are not significatively different. Duncan’s Multiple Rage Test
(DMRT) (* ≤ 0.05).
Conclusions
Strains morphologically identified as F. solani were primarily isolated from tequila agave plants with symptoms of wilting and necrosis at the base of the stem and crown.
When comparing the ITS1-5.8S-ITS2 sequences of strains obtained from Agave tequilana in the GenBank data base, were molecularly identified as Fusarium solani and were included in the F. solani species complex (FSSC).
A comparison of these same sequences with the FUSAROID-ID database led to determining a high similarity with those from the Neocosmospora martii, N. pseudoradicicola, N. solani and N. falciformis phylogenetic species, which are reported as synonymous with Fusarium martii, F. pseudoradicicola, F. solani and
F. falciformis, displaying their genetic variability.
Sequences of the fragment ITS1-5.8S-ITS2 of the isolations obtained from Agave tequilana were molecularly different from the F. solani f. spp, with the exception of the f. sp. eumartii which is very similar to N. martii and the f. sp. radicicola, which is very similar to N. falciformis. This information, along with the absence of introns in the sequence of the 18S (SSU) fraction, supports that none of the strains obtained from A. tequilana belong to the f. sp. phasioli.
Strains representative of Neocosmospora isolated from A. tequilana were phytopathogenic to agave, “Morado” maize and to maize varieties without resistance to Fusarium. On the other hand, maize varieties resistant to Fusarium were not susceptible.
In pathogenicity tests, none of the strains was pathogenic to the inoculated bean
plants, which seems to confirm the molecular findings in this regard.
Acknowledgments
The authors wish to thank Casa Cuervo S.A. de C.V. for their support in the field sampling. Part of this project was supported by the Tecnológico Nacional de México (TecNM) through project number 5434.14-P. VMB thanks the National Science and Technology Council (CONACyT) for the scholarship for the MSc. degree.