rmfi Revista mexicana de fitopatología Rev. mex. fitopatol 0185-3309 2007-8080 Sociedad Mexicana de Fitopatología A.C. 10.18781/R.MEX.FIT.2408-1 Artículo Científico Caracterización de Sclerotium rolfsii y especies de Trichoderma en cultivos comerciales de papa en Sonora y Sinaloa, México Irazoqui-Acosta María Belén 1 Felix-Gastelum Rubén 1 * Leyva-Madrigal Karla Yeriana 1 Longoria-Espinoza Rosa Maria 1 Herrera-Rodríguez Gabriel 2 Armenta-López Sara Elodia 2 Universidad Autónoma de Occidente, Unidad Los Mochis, Departamento de Ciencias Naturales y Exactas, Boulevard Macario Gaxiola y Carretera Internacional, S/N, Los Mochis, Sinaloa, México. CP. 81223. Universidad Autónoma de Occidente Universidad Autónoma de Occidente Los Mochis Sinaloa 81223 Mexico Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte. Lázaro Cárdenas, 315 Pte. Col. Centro, Los Mochis Sinaloa, CP. 81200. México. Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte Junta Local de Sanidad Vegetal del Valle del Fuerte Los Mochis Sinaloa 81200 Mexico *Autor de Correspondencia: Rubén Félix-Gastelum ruben.felix@uadeo.mx 30 09 2025 Sep-Dec 2025 43 3 rmexfit24081 09 08 2024 22 08 2025 Este es un artículo publicado en acceso abierto bajo una licencia Creative Commons RESUMEN

Antecedentes/Objetivo.

Sclerotium rolfsii causa pérdidas en la producción de papa (Solanum tuberosum) de hasta 20 % en los estados de Sonora y Sinaloa. No existen estudios sustentados con el método científico sobre la identificación del hongo, ni de las especies de Trichoderma presentes en suelo con potencial para control de S. rolfsii. Los objetivos del presente estudio fueron: a) Obtener aislados de S. rolfsii de predios de papa de Sonora y Sinaloa, y determinar la densidad poblacional de esclerocios del hongo; b) Aislar, cuantificar la densidad poblacional e identificar morfológica y molecularmente aislados de Trichoderma spp., en los mismos suelos con el fin de emplearlos en estudios subsiguientes para el control y d) Determinar la patogenicidad de S. rolfsii en tubérculos de papa en condiciones de laboratorio.

 Materiales y Métodos.

Los aislados se recolectaron en 239 predios comerciales de papa en Sonora y Sinaloa. La densidad poblacional se determinó por conteo de esclerocios de S. rolfsii y las Unidades Formadoras de Colonias (UFC g-1) de Trichoderma. La identificación se realizó mediante estudios morfométricos y moleculares a través de PCR, secuenciación y análisis filogenético del Espaciador Transcrito Interno (ITS) de S. rolfsii y la subunidad de ARN polimerasa II (RPB2) de Trichoderma spp. La patogenicidad de S. rolfsii se determinó en tubérculos de papa var. Fianna.

 Resultados.

Se identificaron 20 aislados de S. rolfsii cuya densidad poblacional varió de 2 a 24 esclerocios kg-1 de suelo. Por otro lado, se identificaron 26 aislados de Trichoderma spp., de los cuales 16 correspondieron a T. asperellum, cinco a T. asperelloides, cuatro a T. afroharzianum y uno a T. azevedoi con densidad poblacional de 2 a 8 UFC g-1 de suelo. Los aislados de S. rolfsii resultaron patogénicos en tubérculos de papa var. Fianna, con diferentes grados de agresividad.

 Conclusión.

Se demostró la presencia de Sclerotium rolfsii en 8.4 % de los 239 predios de papa muestreados en Sonora y Sinaloa durante los ciclos 2019-2022, con densidades de 2 a 24 esclerocios kg-1 de suelo. La confirmación del patógeno mediante métodos convencionales y moleculares, así como su capacidad para inducir pudrición blanda en tubérculos var. Fianna, evidencia su impacto potencial productivo. La agresividad de los aislados fue variable, destacando el aislado Scr4, con penetración de hasta 16.9 mm y 10.5 % de pudrición. Paralelamente, se identificaron 26 aislados de Trichoderma spp. en 10.9 % de los predios, con densidades de 2 a 8 UFC g-1 de suelo. T. asperellum en Sinaloa y T. asperilloides en Sonora fueron los más prevalentes.

Estos hallazgos subrayan la importancia de incorporar estrategias sustentables de manejo, considerando tanto la variabilidad del patogénica como la posible aplicación de antagonistas nativos. Además, resaltan la necesidad de investigar la dinámica del patógeno y las prácticas agrícolas que minimicen su prevalencia y carga de inóculo regional.

 Palabras clave: Hongo Identificación Densidad poblacional Patogenicidad Agresividad Introducción

La papa (Solanum tuberosum) es considerada uno de los cultivos más importantes en cuanto a su producción mundial, después del trigo (Triticum spp.) y el arroz (Oryza sativa) (FAO, 2024). En México, la producción de papa se estima en 1,986198 t (SIAP, 2023), siendo los estados de Sonora y Sinaloa los principales productores donde resaltan las variedades: Fianna, Orquesta, Atlantic, FL-1867, FL-2027, FL-2395 y FL-2312, representando el 52.4 % de la producción nacional (SIAP, 2023). El rendimiento está determinado por diversos factores en el manejo del cultivo, entre los cuales destacan las enfermedades de origen biótico, que afectan el desarrollo de la planta y la calidad de los tubérculos (Herrera y Scott, 1993). Los hongos, bacterias, nematodos y virus que afectan al tubérculo producen: manchas foliares, agallas, mosaicos, pudriciones, entre otros (Fiers et al., 2012).

La pudrición blanda, es una enfermedad ocasionada por el hongo Sclerotium rolfsii. Los síntomas consisten en lesiones color marrón en tallo y tubérculos, y en estados avanzados de la enfermedad se observa pudrición blanda con lesiones ligeramente hundidas. Los signos se caracterizan por el desarrollo de micelio blanco y presencia de esclerocios redondeados de color marrón, de 2 a 4 mm de diámetro sobre el tejido infectado (Garibaldi et al., 2007; Roca et al., 2016). Las pérdidas causadas por la enfermedad han alcanzado hasta el 60 % en otras partes del mundo (Haque y Khan, 1977). En Sinaloa, los daños se han estimado en un 20 % en lotes comerciales de papa.

S. rolfsii es un hongo necrotrófico habitante del suelo, con alta capacidad de desarrollo saprófito; se considera un patógeno de gran importancia económica en la agricultura, por su amplio rango de hospedantes, amplia distribución geográfica y su capacidad de supervivencia mediante la formación de esclerocios y micelio, logrando sobrevivir en materia orgánica muerta u hospedantes alternativos (Aycock, 1966; Punja, 1985).

En años recientes, en Sinaloa y Sonora se han observado síntomas de pudrición blanda en el cultivo de papa. Cabe resaltar que se han realizado estudios para el control de esta enfermedad, en los que se han determinado las dosis adecuadas de fungicidas para su control (Browne et al., 2002). Sin embargo, el alto costo, las regulaciones ambientales y la toxicidad de los fumigantes limitan el uso de este tipo de moléculas en el manejo de la enfermedad (García-González et al., 2022). También se ha recurrido a la aplicación de especies de Trichoderma como agentes de biocontrol, las cuales han mostrado ser eficaces (Guzmán et al., 2014; Zúñiga y Ceja, 2017). Martínez-Martínez et al. (2020) realizaron un estudio en México, en el cual se utilizaron cepas de diferentes especies de Trichoderma contra el crecimiento micelial de S. rolfsii, resultando en una alternativa viable, tanto in vitro como in planta, para el control de este fitopatógeno en garbanzo. Sin embargo, no se ha realizado investigación en México sobre esta enfermedad en el cultivo de papa.

Por lo anterior, los objetivos del presente estudio fueron: a) obtener aislados de S. rolfsii de suelos sometidos al cultivo de papa (S. tuberosum) en los estados de Sonora y Sinaloa, y determinar la densidad poblacional de esclerocios del hongo; b) aislar, cuantificar la densidad poblacional e identificar morfológica y molecularmente aislados de Trichoderma spp., en los mismos suelos con el fin de emplearlos en estudios subsiguientes para el control de la enfermedad y d) determinar la patogenicidad de S. rolfsii en tubérculos de papa en condiciones de laboratorio.

 Materiales y Métodos

Recolecta de muestras. Durante el desarrollo del trabajo, se recolectaron muestras de suelo de 239 predios de zonas productoras de papa en Sonora y Sinaloa, en los ciclos agrícolas otoño-invierno 2019-2020, 2020-2021 y 2021-2022. Se seleccionaron predios comerciales de papa de 10 hectáreas, en los que se colectaron cinco submuestras de 500 g por el método de ‘cinco de oros’. Las submuestras se homogenizaron, tomando 1 kg como muestra final. Las muestras se etiquetaron y procesaron en condiciones de laboratorio.

Densidad poblacional, aislamiento y caracterización morfológica de aislados de S. rolfsii. Para determinar las poblaciones de S. rolfsii, se extrajeron esclerocios de las muestras de suelo, utilizando la técnica de flotador de Fenwick (Van-Bezooijen, 2006). Se utilizaron 500 g de muestra de suelo seco y se depositaron en un tamiz número 20 (850 µm), sobre el flotador. En la salida de agua, se colocó un tamiz número 60 (250 µm). Posteriormente, las partículas retenidas se secaron a la sombra, sobre papel absorbente durante 24 h. Las partículas se observaron bajo el microscopio estereoscópico (Carl Zeiss®; SteREO Discovery.V20, Alemania); se colectaron y cuantificaron los esclerocios obtenidos en la muestra. Enseguida, se desinfestaron en una solución de hipoclorito de sodio al 1 % por un min y se sembraron en medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) (BD Bioxon®) suplementado con cloranfenicol (15 μg mL-1) (Armenta-López et al., 2021). Las cajas se incubaron a 27 °C por 48 h (Yamato Scientific Co., LTD®; Economy Incubator IN804, Tokio, Japón). Del punto de crecimiento de la colonia, se tomó y transfirió un disco de 5 mm de diámetro a cajas Petri con PDA y se incubó a 27 °C.

Para la identificación morfológica de Sclerotium spp. se colocó un disco de PDA de 5 mm de diámetro con crecimiento activo de cada aislado, en el borde de tres cajas Petri de 90 mm con el mismo medio. Las cajas se incubaron a 27 °C hasta que el hongo llenó la caja. Para determinar la tasa de crecimiento micelial, se utilizó la fórmula: TC = (Crecimiento final - Crecimiento inicial) / tiempo de incubación (Guigón-López et al., 2010). Se describió la morfología colonial: color de colonia en la caja (anverso y reverso); forma y tipo de micelio. Además, se registraron las características de las hifas y la formación de fíbulas y el color de los esclerocios (Paparu et al., 2020). Adicionalmente, se evaluó el número promedio de esclerocios producidos y se determinó su tamaño en una muestra de 30 esclerocios por caja Petri en cada uno de los aislados (Prasad et al., 2012).

Densidad poblacional, aislamiento y caracterización morfológica de aislados de Trichoderma spp. Para la obtención de aislados de Trichoderma spp., de cada muestra se pesó 0.5 g de suelo (Ohaus Corporation®; YS600, China), se espolvoreó sobre la superficie de una caja Petri con PDA y se incubó por 10 días a 27 °C. Una vez desarrolladas las colonias con morfología típica del género (Gary y Prakash, 2015), se realizó la cuantificación de estas por caja Petri, se transfirieron a cajas con el mismo medio y se incubaron a 27 °C. Las colonias de Trichoderma se purificaron con la técnica de cultivo monospórico de Estrada et al. (1997). De cada aislado de Trichoderma se tomaron discos de micelio de 5 mm de diámetro y se transfirieron a PDA, Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA) (modificado por Nirenberg, 1976) y Harina de Maíz Agar (HMA) (BD BBL®), en el borde de cajas Petri de 90 mm de diámetro (tres réplicas por cada medio). Las cajas se incubaron durante siete días en cámara bioclimática (Thermo Scientific®; Precision 3759, USA), utilizando luz fluorescente blanca-fría a 25 °C (Pacheco et al., 2016). El crecimiento micelial se midió cada 24 h, hasta que éste llenó la caja en PDA y SNA. Se registraron las medidas desde el borde del disco de inóculo hasta el punto más distante de la colonia. Para determinar la tasa de crecimiento se utilizó la fórmula anteriormente descrita (Guigón- López et al., 2010). En el medio PDA y SNA se evaluó el color y borde de la colonia, tipo de micelio, mientras que en HMA se determinó el tamaño de pústula conidial, tipo de desarrollo, la forma del conidióforo, posición de la clamidospora, forma y tamaño de fiálides y conidios. Las estructuras se montaron en portaobjetos, utilizando la técnica de cinta adhesiva y glicerina (Gary y Prakash, 2015), y se observaron bajo el microscopio compuesto con el objetivo 100x (Carl Zeiss®; Axio Imager M2, Alemania). Se registró la forma y dimensión (μm) de 30 fiálides y 30 conidios, en cada aislado.

Identificación molecular de S. rolfsii y Trichoderma spp. Se colocaron tres discos de cada aislado en tubos de centrífuga que contenían 25 mL de caldo nutritivo. Los cultivos se incubaron a 27 °C con agitación constante durante cinco días a 150 rpm (Labnet International, Inc.®; Labnet Incubator Shaker 311DS, USA). El micelio se colocó en tubos Eppendorf de 2 mL. El ADN genómico se obtuvo empleando el método de CTAB al 2 % (Sanger et al., 1977) y al final se ajustó a 50 ng μL-1. La presencia e integridad de ADN se verificó mediante electroforesis (Thermo Scientific®; Electrophoresis Power Supply EC1000XL, China) en gel de agarosa al 1 %. Se observaron las bandas en un fotodocumentador (BIORAD®; Universal Hood ll, USA). La concentración y calidad de ADN se determinó en un NanoDrop (Thermo Scientific®; NanoDrop One ND-ONE, USA).

La identificación molecular de los aislados de Sclerotium, se realizó mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para amplificar un fragmento de 670 ± pb del Espaciador Transcrito Interno (ITS: Internal Transcribed Spacer) con los oligonucleótidos ITS1 (5´ TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG 3´) e ITS4 (5´ TCC TCC GCT TAT TGA

TAT GC 3´) (White et al., 1990). Los oligonucleótidos fRPB2-5F (5’ GAT CGA TCA CGA TGA TCA TCT TTC GG 3’) y fRPB2-7cR (5’ CCC ATA GGC TTG TCT TAG

CCC AT 3’) (Liu et al., 1999), se utilizaron para amplificar un fragmento de 1100 ± pb de la subunidad de ARN polimerasa II (RPB2) (Chaverril et al., 2003). La mezcla de reacción para cada muestra fue de 25 µL, la cual contenía 1X de buffer, 0.2 µg µL-1 de BSA, 0.2 mM de dNTP´s, 1.5 mM de MgCl2, 0.5 µM de cada oligonucleótido, 0.1 U µL-1 de Taq polimerasa (Promega®) y 50 ng de ADN. El volumen final se ajustó con agua ultrapura. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: desnaturalización inicial de 94 °C durante 5 min, 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C por 30 s, alineamiento (57 °C para ITS y 54 °C para RPB2) por 40 s y extensión a 72 °C por 45 s, seguidos de una extensión final a 72 °C por 5 min, en un Termociclador (BIORAD®; C1000 Thermal Cycler CFX96, Singapore). Se utilizaron 5 µL de producto de reacción y 1X de buffer de carga (Promega®), para realizar la electroforesis en gel de agarosa al 1.5 %. Los fragmentos amplificados fueron observados utilizando el fotodocumentador y enviados para secuenciación a la compañía Macrogen® Seúl, Corea.

Las secuencias de la región ITS para S. rolfsii y el gen RPB2 para Trichoderma, se editaron en el programa BioEdit versión 7.2.5 (Hall, 1999), y se compararon en la base de datos GenBank, utilizando el algoritmo BLASTn. Las secuencias obtenidas se alinearon con secuencias de referencia, pertenecientes a cepas tipo de las distintas especies de los complejos de Trichoderma: p.e. T. harzianum y T. viride, y cepas tipo pertenecientes a Sclerotium rolfsii, utilizando el software MUSCLE (Edgar, 2004) implementado en MEGA X versión 10.2.4 (Kumar et al., 2018). Las secuencias de Ceratobasidium cornigerum (AJ302006) y Protocrea pallida (CBS 121552) fueron utilizadas como grupo externo en el análisis filogenético de Sclerotium y Trichoderma, respectivamente. El alineamiento se sometió a una prueba de ajuste de modelo de sustitución nucleotídica y esquema de particiones en el programa PartitionFinder v1.1.1 (Lanfear et al., 2012), siguiendo el algoritmo greedy y el criterio de información de Akaike (AIC). La inferencia filogenética de Trichoderma se realizó mediante Máxima Verosimilitud (MV) en el programa RAxML v7.2.8 (Stamatakis, 2006) e Inferencia Bayesiana (IB) en MrBayes 3.2.7 (Ronquist et al., 2012) mientras que la de Sclerotium sólo se hizo por MV. En ambos análisis se utilizó el modelo General Time Reversible con distribución gamma y sitios invariables (GTRGAMMAI) y el esquema de particiones definido por PartitionFinder. En el análisis de MV se emplearon 1,000 réplicas bootstrap, y para el de IB se emplearon dos corridas simultáneas de 1 millón de generaciones con seis cadenas de Markov y Monte Carlo, muestreos cada 1,000 árboles filogenéticos y la eliminación (burnin) del 20 % de los árboles. La estabilidad y convergencia de las corridas se evaluó en Tracer ver. 1.7.2 (Rambaut et al., 2018). Los Filogramas se editaron en FigTree v1.4.0 (Rambaut, 2014).

Patogenicidad de Sclerotium rolfsii en tubérculos de papa. Se evaluó la patogenicidad de 20 aislados de S. rolfsii (Scr2, Scr3, Scr4, Scr5, Scr6, Scr7, Scr8, Scr9, Scr10, Scr11, Scr12, Scr13, Scr14, Scr17, Scr47, Scr48, Scr49, Scr50, Scr51 y Scr54) obtenidos del muestreo de suelos cultivados con papa en Sonora y Sinaloa. Se utilizaron tubérculos de papa variedad Fianna, éstos se lavaron y desinfectaron superficialmente con alcohol al 70

%. Se usaron cinco tubérculos sanos por tratamiento y se colocaron en cámaras húmedas para lograr alta humedad relativa. En los tubérculos se provocó una lesión superficial con un sacabocado de 5 mm de diámetro, y sobre la lesión se colocó un disco de 5 mm de PDA con crecimiento activo del hongo. Como testigo, se inocularon tubérculos con discos de PDA sin el hongo. Los tubérculos inoculados y testigos se colocaron en cámara bioclimática a 27 °C (Daami-Remadi et al., 2012). Los datos de temperatura y humedad dentro de la cámara húmeda se registraron con un Data Logger (MadgeTech®; RFRHTemp2000A, Wireless Temperature / Humidity Data Logger, USA) cada hora durante la prueba.

La patogenicidad y virulencia de los aislados en los tubérculos, se determinó ocho días después de la inoculación con el patógeno, para lo cual los tubérculos se cortaron transversalmente, en el centro de la lesión y se midieron el ancho máximo (A) y profundidad (PR) de la lesión, para determinar la penetración del patógeno (P), la cual se calculó recurriendo a la fórmula de Lapwood et al. (1984): P (mm) = (A / 2 + (PR - 6)) / 2. También se estimó el porcentaje de pudrición blanda del tejido de los tubérculos, utilizando la metodología de Bourne et al. (1981) y Hildenbrand y Ninnemann (1994), que consiste en pesar cada tubérculo (PT), posteriormente extraer el tejido dañado (podrido) y pesar de nuevo (PS). Para determinar el porcentaje de tejido con pudrición se utilizó la siguiente formula (%) = (PT - PS / PT) × 100. Posteriormente, se aisló al patógeno del tejido que presentó síntomas característicos de la enfermedad, y se identificó morfológicamente para completar los postulados de Koch. El experimento se desarrolló en dos ocasiones.

Análisis estadísticos de datos. La normalidad de los datos sobre penetración y porcentaje de pudrición blanda por el patógeno se verificó mediante la prueba de Kolmogorov- Smirnov con el paquete estadístico SAS 9.0. Los análisis mostraron que la distribución de los datos no fue normal, por lo que se sometieron a análisis no paramétrico de Kruskal- Wallis con un valor de (P>0.05).

 Resultados y Discusión

Densidad poblacional y caracterización morfológica y molecular de aislados de S. rolfsii. Se obtuvieron 20 aislados de S. rolfsii de un mismo número de predios de un total de 239 predios muestreados en Sonora y Sinaloa, lo cual representó el 8.4 % de los lotes con presencia del hongo; la densidad poblacional varió de 2 a 24 esclerocios por kg de suelo (Cuadro 1). Los aislados presentaron micelio de color blanquecino con apariencia fibrosa y algodonosa, en forma de abanico (Figura 1A). Hifas hialinas, septadas, con presencia de fíbulas (Figura 1B). Se observaron tonalidades de blanquecina a amarillenta en el reverso de las colonias similar a lo reportado por Paparu et al. (2020). Según Mahadevakumar et al. (2018), S. rolfsii presenta distintas características morfológicas, tanto en su colonia como en los esclerocios, influenciado por la amplia gama de hospedantes y condiciones climáticas en donde se desarrolla. Los aislados presentaron un crecimiento radial de 4-16 mm/día, hasta alcanzar 90 mm de diámetro en la caja Petri, entre cinco y ocho días de incubación (Prasad et al., 2012). Okereke y Wokocha, (2007) reportaron que la variación en el crecimiento de los aislados se debe a diferencias en los niveles de nutrientes, ecología o diferencias genéticas. Los esclerocios se desarrollaron de 10 a 20 días después de la siembra, y variaron de 0.5 a 2 mm de diámetro. Los aislados formaron entre 18 a 153 esclerocios por caja Petri. Los esclerocios exhibieron color marrón claro a marrón oscuro conforme a su grado de maduración, similares a las estructuras morfológicas publicadas por Zhou et al. (2019). Asimismo, el tamaño de los esclerocios fue similar a lo registrado por Díaz-Nájera et al. (2018).

Identificación, densidad poblacional y origen de colecta 20 aislados de <italic>S. rolfsii</italic> obtenidos de suelo de 20 predios comerciales de papa (<italic>S. tuberosum</italic>) de un total 239 predios muestreados en Sonora y Sinaloa.
Código Identificación Esclerocios/kg de suelo Ciclo agrícola Municipio/Estado Coordenadas Código GenBank
Scr2 S. rolfsii 8 2019-2020 El Fuerte, Sinaloa 25.942500 -108.809166 OR514111
Scr3 S. rolfsii 10 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.777500 -109.040277 OR514112
Scr4 S. rolfsii 24 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.701944 -109.043333 OR514113
Scr5 S. rolfsii 6 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.851944 -108.885000 OR514114
Scr6 S. rolfsii 12 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.669722 -109.006111 OR514115
Scr7 S. rolfsii 10 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.769444 -109.045000 OR514116
Scr8 S. rolfsii 20 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.836944 -108.926388 OR514117
Scr9 S. rolfsii 4 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.691944 -109.010277 OR514118
Scr10 S. rolfsii 6 2019-2020 El Fuerte, Sinaloa 25.944917 -108.908333 OR514119
Scr11 S. rolfsii 2 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.743611 -108.998610 OR514120
Scr12 S. rolfsii 4 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.876111 -108.835000 OR514121
Scr13 S. rolfsii 2 2019-2020 Guasave, Sinaloa 25.652500 -108.763888 OR514122
Scr14 S. rolfsii 8 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.789166 -108.895277 OR514123
Scr17 S. rolfsii 18 2019-2020 Ahome, Sinaloa 25.773330 -109.280277 OR514124
Scr47 S. rolfsii 2 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.465355-108.542845 OR514125
Scr48 S. rolfsii 6 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.464949 -108.543231 OR514126
Scr49 S. rolfsii 16 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.465739 -108.541982 OR514127
Scr50 S. rolfsii 10 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.465119 -108.543142 OR514128
Scr51 S. rolfsii 14 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.464987 -108.543004 OR514129
Scr54 S. rolfsii 18 2021-2022 Altar, Sonora 30.945163 -111.830293 OR514130

Con respecto a la producción de esclerocios, los resultados del presente estudio coinciden con lo reportado por Ayed et al. (2018); su formación inició en el mismo periodo registrado por Mahadevakumar et al. (2018). Distinto a lo consignado por Paparu et al. (2020), quienes registran la producción de esclerocios 28 días después de su crecimiento en PDA.

Características morfológicas de <italic>Sclerotium rolfsii</italic> (Scr17). (<bold>A</bold>) Morfología colonial en medio PDA, y esclerocios (flecha roja); (<bold>B</bold>) Hifa hialina (flecha amarilla) y fíbulas en septo (flecha azul) (100x). Escala: (B= 50 µm).

El filograma de Máxima Verosimilitud, generado con las secuencias de la región ITS de los 20 aislados de Sclerotium provenientes de 20/239 predios se ilustra en la Figura 2.

Análisis filogenético de aislados de <italic>Sclerotium rolfsii</italic> de Sonora y Sinaloa (<xref ref-type="table" rid="t1">Cuadro 1</xref>). Árbol de máxima verosimilitud basado en el Espaciador Transcrito Interno (ITS) de 20 aislados de <italic>S. rolfsii</italic>. Los aislados caracterizados en este estudio aparecen en negritas. Los valores bootstrap mayores a 50 se muestran como porcentajes. La barra de escala indica el número esperado de sustituciones de nucleótidos.

El análisis demostró que los 20 aislados: Scr2, Scr3, Scr4, Scr5, Scr6, Scr7, Scr8, Scr9, Scr10, Scr11, Scr12, Scr13, Scr14, Scr17, Scr47, Scr49, Scr49, Scr50, Scr51 y Scr54 pertenecen a la especie Sclerotium rolfsii; puesto que se agrupan con las secuencias de los aislados tipo C13 (KY175225), CBS 115.22 (MH854711) y AFTOL-ID (DQ484062) de

esta especie con homologías superior al 95 % y con un alto soporte bootstrap (80 %) (Figura 2), resultados que coinciden con lo reportado por Mahadevakumar et al. (2018).

Densidad poblacional y caracterización morfológica y molecular de aislados de especies de Trichoderma. Se obtuvieron 26 aislados de Trichoderma spp. de suelos de 26

/ 239 predios de Sonora y Sinaloa, lo cual representó el 10.9 % de los lotes con presencia del hongo; con una densidad poblacional de 2 a 8 Unidades Formadoras de Colonias por gramo de suelo (UFC g-1) (Cuadro 2).

Identificación, densidad poblacional y origen de colecta de 26 aislados de <italic>Trichoderma</italic> obtenidos de suelos de predios comerciales de papa (<italic>S. tuberosum</italic>) en Sonora y Sinaloa.
Código Especies x UFC g-1 Ciclo agrícola Municipio/Estado Coordenadas Código GenBank
TES19 T. asperelloides 4 2020-2021 Caborca, Sonora 31.041666 -112.331111 OR521159
TES20 T. asperelloides 2 2020-2021 Altar, Sonora 31.062222 -111.834722 OR521160
TAF21 T. afroharzianum 6 2020-2021 Altar, Sonora 30.909444 -111.804444 OR521161
TAM22 T. asperellum 4 2020-2021 Caborca, Sonora 30.541388 -112.273611 OR521162
TES23 T. asperelloides 8 2020-2021 Caborca, Sonora 31.995555- 112.360277 OR521163
TES24 T. asperelloides 6 2020-2021 Caborca, Sonora 31.066660- 112.338333 OR521164
TES26 T. asperelloides 4 2020-2021 Caborca, Sonora 30.660000 -111.270550 OR521165
TAM27 T. asperellum 2 2019-2020 Guasave, Sinaloa 25.722955 -108.740276 OR521166
TAM30 T. asperellum 2 2019-2020 El Fuerte, Sinaloa 25.944916 -108.908333 OR521167
TAM31 T. asperellum 2 2019-2020 Guasave, Sinaloa 25.655277 -108.561944 OR521168
TAF33 T. afroharzianum 4 2020-2021 S. de Leyva, Sin. 25.952500 -108.406388 OR521169
TAM35 T. asperellum 4 2020-2021 Ahome, Sinaloa 25.760550 -109.266388 OR521170
TAM37 T. asperellum 6 2020-2021 Guasave, Sinaloa 25.712500 -108.782222 OR521171
TAF38 T. afroharzianum 8 2020-2021 Guasave, Sinaloa 25.580833 -108.603055 OR521172
TAM57 T. asperellum 8 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.481112 -108.571717 OR521173
TAM59 T. asperellum 6 2021-2022 Guasave, Sinaloa 25.679176 -108.665316 OR521174
TAM64 T. asperellum 4 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.819266 -108.955429 OR521175
TES65 T. asperelloides 4 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.491132 -108.571830 OR521176
TAM67 T. asperellum 2 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.491299 -108.571854 OR521177
TAM68 T. asperellum 2 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.491496 -108.571569 OR521178
TAM69 T. asperellum 2 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.491299 -108.571854 OR521179
TAM70 T. asperellum 4 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.498320 -108.571704 OR521180
TAI73 T. azevedoi 2 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.498320 -108.572148 OR521181
TAM74 T. asperellum 4 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.491445 -108.571659 OR521182
TAF75 T. afroharzianum 4 2021-2022 Ahome, Sinaloa 25.498320 -108.572148 OR521183
TAM76 T. asperellum 6 2020-2021 Caborca, Sonora 31.995555 -112.360277 OR521184

x Las especies se identificaron con base a las característica morfológicas y moleculares.

Con base en las características morfológicas, se determinó que los aislados de Trichoderma pertenecían a dos complejos de especies: 21 aislados pertenecieron al complejo T. viride (TES19, TES20, TAM22, TAM23, TES24, TES26, TAM27, TAM30, TAM31, TAM35, TAM37, TAM57, TAM59, TAM64, TES65, TAM67, TAM68, TAM69,

TAM70, TAM74 y TAM76) (Cuadro 3; Figura 3) y cinco pertenecieron al complejo T. harzianum (TAF21, TAF33, TAF38, TAI73 y TAF75) (Cuadro 3; Figura 4).

Los aislados del complejo T. viride presentaron una tasa de crecimiento en PDA de 10- 18 mm/día, y en SNA de 8-14 mm/día (Cuadro 3), similar a lo reportado por Guigón-López et al. (2010). La morfología colonial fue similar para todos los aislados en HMA, donde el color de la colonia varió de verde claro a verde oscuro a medida que estas maduraban, el borde fue ondulado y suave, con apariencia flocosa a aracnoidea, micelio de color blanco acuoso e hifas hialinas (Cuadro 3; Figura 3A y B) (Rai et al., 2019). Pústulas conidiales de color verde oscuro de 1-2 mm de diámetro (Cuadro 3; Figura 3C). Conidióforos largos y ramificados (Cuadro 3; Figura 3D y E). Conidios subglobosos a ovoides, lisos, de 2.5-3.8 µm de largo y 2.0-3.0 µm de ancho (Cuadro 3; Figura 3F). Fiálides lageniformes-delgadas con terminación ramificada, de 4.2-14.3 µm de largo y 2.6-5.0 µm de ancho (Cuadro 3; Figura 3D y E). No se observó presencia de clamidosporas (Cuadro 3) (Gary y Prakash, 2015).

En contraste, los aislados del complejo T. harzianum presentaron tasa de crecimiento de 11-19 mm/día en PDA y 11-17 mm/día en SNA (Cuadro 3; Figura 4A y B), concordando con los rangos reportados por Gary y Prakash, (2015). En HMA, las pústulas conidiales mostraron color verde claro (Cuadro 3; Figura 4C) (Rai et al., 2019), conidios subglobosos, lisos, de 2.0-3.0 µm de largo y 1.6-2.3 µm de ancho (Cuadro 3; Figura 4H). Fiálides ampuliformes con cuello distintivo y estrecho en la punta de 5.8-7.2 µm largo y 2.5-3.0 µm de ancho (Cuadro 3; Figura 4F y G). Se observó la presencia de clamidosporas intercalares y terminales (Cuadro 3; Figura 4D y E) (Gary y Prakash, 2015).

Características morfológicas de aislados de los complejos de especies <italic>Trichoderma viride</italic> y <italic>Trichoderma harzianum</italic> en tres medios de cultivo.
Caracteristicas morfológicasZ Medio de cultivo T. viride T. harzianum
Colonia Crecimiento radial (mm/día) PDA 10-18 11-19
SNA 8-14 11-17
PDA
Color SNA Verde claro a verde oscuro Verde claro a verde oscuro
HMA
Pústula conidial Tamaño (mm) HMA 1-2 1-2
Micelio Forma PDA y Flocosa y aracnoideo Flocosa y aracnoideo
Color de hifas HMA Hialinas Hialinas
Conidio Forma HMA Subglobosos, ovoide, liso, verrugoso Subglobosos, liso
Tamaño (largo) 2.47-3.78 μm 2.03-2.99 μm
Tamaño (ancho) 2.02-3.05 μm 1.64-2.30 μm
Conidióforos Forma HMA Largo y ramificado Ramificados
Clamidosporas Posiciòn HMA Sin presencia Terminales e intercaladas
Fiálides Forma HMA Lageniformes y delgadas Ampuliformes
Tamaño (largo) 4.2-14.3 μm 5.8-7.2 μm
Tamaño (ancho) 2.6-5.0 μm 2.5-3.0 μm

ZLas características morfológicas se determinaron en colonias de 2 a 3 días de edad con régimen de 12 horas luz. En negritas características más distintivas.

El filograma de Máxima Verosimilitud del gen RPB2 para el complejo T. viride identificó a dos especies entre los 16 aislados analizados. Los aislados TAM76, TAM67, TAM30, TAM35, TAM37, TAM57, TAM23, TAM59, TAM27, TAM69, TAM22,

TAM31, TAM70, TAM68, TAM64 y TAM74 se agruparon con las secuencias de las cepas

Morfología colonial y microscópica de <italic>T. asperelloides</italic> (TES19). (<bold>A</bold>) colonia en medio de cultivo PDA. (<bold>B</bold>) colonia en medio de cultivo SNA. (<bold>C</bold>) pústulas conidiales. (<bold>D y E</bold>) conidióforos y (<bold>F</bold>) conidios (100x). (C-F) en medio HMA. Escala: (C= 2 mm) (D= 10 µm) (E y F= 5 µm). Especie del complejo <italic>T. viride</italic>.

Morfología colonial y microscópica de <italic>Trichoderma afroharzianum</italic> (TAF33). (<bold>A</bold>) colonia en medio de cultivo PDA. (<bold>B</bold>) colonia en medio de cultivo SNA. (<bold>C</bold>) pústulas conidiales. (<bold>D y E</bold>) clamidosporas y (<bold>F y G</bold>) conidióforos (<bold>H</bold>) conidios (100x). (C-H) en medio HMA. Escala: (C= 2 mm) (D y H= 5 µm) (E, F y G= 10 µm). Especie del complejo <italic>T. harzianum</italic>.

GJS 01-15, TR3(T) y GJS 02-63 de Trichoderma asperellum¸ con un soporte bootstrap de 78 % y PP de 0.99, mientras que los aislados TES19, TES20, TES26, TES24 y TES65 se agruparon con las cepas GJS 02-63, GJS 04-111(T) y CML 2676 de Trichoderma asperelloides (Bootstrap 98 %; PP 1; Figura 5). Por otro lado, el filograma del complejo T. harzianum confirmó que los aislados TAF21, TAF38, TAF75 y TAF33 pertenecen a la especie Trichoderma afroharzianum, ya que se agrupan con las secuencias de las cepas de esta especie, CEN1417, CEN1410, GJS 04-186(T) y CBS 466.94, con un alto soporte

bootstrap (92 %) y alta probabilidad (1). Por otro lado, el aislado TAI73 se identificó como Trichoderma azevedoi, al formar un clado con las cepas de esta especie, CEN1423, CEN1403 y CEN1422(T) (Bootstrap 53 % y PP 0.72) (Figura 6). Estas especies están ampliamente distribuidas, por ejemplo, Jaklitsch y Voglmayr (2015) y Athafah et al. (2020) reportan tres especies de Trichoderma con base a la región RPB2 (T. asperellum, T. asperelloides y T. afroharzianum) de zonas boscosas. Por otra parte, Inglis et al. (2020) identificaron a T. azevedoi con la misma región genómica, en muestras de suelo recolectadas de cultivos de ajo y cebolla en ocho sitios diferentes en Brasil.

Filograma de Máxima Verosimilitud del complejo de especies <italic>Trichoderma viride</italic>, basado en la subunidad de ARN polimerasa II (RPB2). Los 21 aislados de <italic>Trichoderma</italic>, obtenidos de predios comerciales de papa de Sonora y Sinaloa, caracterizados en este estudio (<xref ref-type="table" rid="t2">Cuadro 2</xref>), aparecen en negrita. Los valores bootstrap >50 y de probabilidad posterior >0.5 se muestran en los nodos. La barra de escala indica el número esperado de sustituciones de nucleótidos.

Filograma de Máxima Verosimilitud del complejo de especies <italic>Trichoderma harzianum</italic>, basado en la subunidad de ARN polimerasa II (RPB2). Los cinco aislados de <italic>Trichoderma</italic> obtenidos de predios comerciales de papa de Sonora y Sinaloa caracterizados en este estudio (<xref ref-type="table" rid="t2">Cuadro 2</xref>), aparecen en negrita. Los valores Bootstrap >50 y de probabilidad posterior >0.5 se muestran en los nodos. La barra de escala indica el número esperado de sustituciones de nucleótidos.

Patogenicidad de Sclerotium rolfsii en tubérculos de papa. Después de ocho días de la inoculación, todos los tubérculos de papa var. Fianna inoculados con los aislados de S. rolfsii mostraron síntomas de pudrición blanda (Paparu et al., 2020; Paul et al., 2021) (Cuadro 4) con variación en los niveles de agresividad entre aislados; característica importante a considerar cuando se evalúa la resistencia genética de variedades de papa contra la enfermedad. Los síntomas fueron similares a las lesiones inducidas por el hongo en campo. Los tubérculos presentaron pudrición blanda circular e irregular, con borde café (Figura 7), mientras que los tubérculos testigo permanecieron sanos durante el período experimental. La penetración de los 20 aislados en los tubérculos varió de 9.5 a 16.9 mm, con diferencias significativas (P > 0.05). La mayor penetración se presentó con el aislado Scr4 (16.9 mm), mientras que el aislado Scr9 mostró la menor penetración (9.5 mm). El aislado Scr7 causó una penetración de 15.2 mm, y no mostró diferencias significativas respecto a los aislados Scr17, Scr48 y Scr10, con una penetración de 14.0, 13.7 y 13.6 mm de forma respectiva (Cuadro 4). Por otro lado, los porcentajes de pudrición variaron de 1.4 a 10.5 % con diferencias significativas (P > 0.05), entre los aislados. El máximo porcentaje de pudrición lo causó el aislado Scr4 (10.5 %) y el mínimo se presentó con el aislado Scr9 (1.4 %), el cual no mostró diferencias significativas respecto a los aislados Scr3, Scr47 y Scr5 con porcentajes de 2.0, 3.9 y 4.5 % de forma respectiva, pero sí respecto al resto de los aislados (P > 0.05). El aislado Scr4, no mostró diferencias significativas (P > 0.05), respecto a los aislados Scr7, Scr10, Scr17, Scr51 y Scr6 con porcentajes de 9.3, 8.4, 8.0, 8.0 y 7.7 %, respectivamente (Cuadro 4). Se observaron síntomas y signos de la enfermedad, similares a los que ocurren en campo lo que coincide con los resultados de Daami-Remadi et al. (2007) cuando demostraron la patogenicidad del hongo en papa var. Spunta. Esto resultados confirma los postulados de Koch y sugieren variabilidad patogénica del hongo a nivel regional.

Penetración de <italic>Sclerotium</italic> rolfsii y porcentaje de pudrición blanda en tubérculos de papa variedad Fianna con inoculación artificial de discos 5mm/PDA-hongo.
Penetración del hongo (mm) % de pudrición blanda
Aislado N Mediax Aislado N Mediax
Control 10 0.0 a Control 10 0.0 a
Scr9 10 9.5 ab Scr9 10 1.4 ab
Scr3 10 10.0 ab Scr3 10 2.0 abc
Scr49 10 11.0 abc Scr47 10 3.9 abcd
Scr5 10 11.1 abc Scr5 10 4.5 abcde
Scr13 10 11.1 abc Scr13 10 4.5 bcde
Scr2 10 11.2 abcd Scr12 10 5.1 cdef
Scr12 10 11.5 bcde Scr8 10 5.3 defg
Scr8 10 12.2 cdef Scr49 10 5.6 defg
Scr14 10 12.3 def Scr2 10 6.0 efg
Scr50 10 12.4 def Scr48 10 6.1 efgh
Scr47 10 12.6 efg Scr14 10 6.2 fgh
Scr6 10 12.7 fg Scr50 10 6.2 fghi
Scr11 10 12.8 fg Scr11 10 7 ghij
Scr51 10 12.9 fg Scr54 10 6.9 ghij
Scr54 10 13.2 fgh Scr6 10 7.7 hijk
Scr10 10 13.6 ghi Scr51 10 8.0 hijk
Scr48 10 13.7 ghi Scr17 10 8.0 ijk
Scr17 10 14.0 ghi Scr10 10 8.4 jk
Scr7 10 15.2 hi Scr7 10 9.3 jk
Scr4 10 16.9 i Scr4 10 10.5 k

x Medias con al menos una letra común no son significativamente diferentes (P > 0.05), Kruskal-Wallis. N=Repeticiones

Síntomas de pudrición blanda en tubérculos de papa variedad Fianna, causados por el aislado Scr17 de <italic>S. rolfsii</italic> mediante inoculación artificial. (<bold>A</bold>) Tubérculos con síntomas de <italic>S. rolfsii</italic> en cámara húmeda. (<bold>B y C</bold>) lesiones con micelio algodonoso causadas por el hongo. (<bold>D</bold>) Corte transversal de tubérculo de papa con pudrición blanda.

Los resultados del presente trabajo son relevantes, pues implican nuevas líneas de investigación, donde se podrían incluir estudios sobre la patogenicidad de S. rolfsii en diferentes cultivos agrícolas, rotación de cultivos y su impacto en las poblaciones de esclerocios como inóculo primario; así como la evaluación de especies de Trichoderma adaptadas regionalmente en la disminución de producción de esclerocios de S. rolfsii y su correlación con la disminución de la incidencia de la enfermedad en campo. Lo anterior, debido a que Trichoderma se ha identificado como agente de control biológico prometedor contra patógenos facultativos adaptados al suelo como S. rolfsii en el cultivo de papa (Rubayet and Bhuiyan, 2016; Chowdhury et al., 2023). El potencial empleo especies endémicas de Trichoderma obtenidas de predios comerciales papa, los cuales se han expuesto a la presión de diversos fungicidas, sugiere que han adquirido resistencia a este tipo de moléculas; lo que implica, que se podrían emplear, alternadamente o en mezcla con fungicidas a los que resulten resistentes, para el manejo de la pudrición blanda de la papa. Una estrategia potencialmente viable bajo una visión sostenible para reducir la cantidad de ingrediente activo total de fungicidas sintéticos.

 Conclusiones

Se muestrearon 239 predios comerciales de papa en Sonora y Sinaloa durante los ciclos agrícolas 2019-2020, 2020-2021 y 2021-2022. El 8.4 % de los predios resultaron positivos para la presencia de S. rolfsii, con una densidad poblacional de 2 a 24 esclerocios por kg de suelo, indicando alto potencial de inóculo e inductividad del sistema productivo y ambiente. La identidad del hongo se confirmó mediante técnicas convencionales y herramientas moleculares. Se confirmó la capacidad de S. rolfsii, para inducir

artificialmente la pudrición blanda en tubérculos de papa var. Fianna, con variación en agresividad entre aislados. La penetración del patógeno osciló entre 9.5 y 16.9 mm, mientras que el porcentaje de pudrición por tubérculo varió de 1.4 a 10.5 %, destacando el aislado Scr4 como el más agresivo. Estos datos indican el potencial de pérdidas productivas que puede causar S. rolfsii.

Se obtuvieron 26 aislados de Trichoderma spp., lo cual representó el 10.9 % de los predios comerciales con presencia de este género (26/239); con una densidad poblacional de 2 a 8 UFC g-1 de suelo. La caracterización morfológica y molecular permitió la identificación de T. asperellum y T. asperelloides, y de T. afroharzianum y T. azevedoi, pertenecientes a los complejos T. viride y T. harzianum, respectivamente. T. asperellum, en Sinaloa y T. asperilloides en Sonora fueron los más prevalentes.

Los hallazgos de este trabajo tienen implicaciones significativas para el manejo de la pudrición blanda de los tubérculos de papa. La identificación de especies de Trichoderma nativas con potencial antagónico implica futuras líneas de investigación relativas a la implementación de estrategias de control biológico, especialmente en sistemas donde la resistencia a fungicidas es una limitante. Además, la variabilidad en la agresividad de S. rolfsii sugiere la necesidad de estudios adicionales para entender su interacción con el hospedante y el ambiente, así como para desarrollar prácticas culturales sostenibles que reduzcan la supervivencia de esclerocios en el suelo.

 Limitaciones. Este trabajo no incluyó pruebas de confrontación <italic>in vitro</italic> o <italic>in vivo</italic> de

Trichoderma y S. rolfsii.

Conflicto de interés. No existente.

Financiamiento. Universidad Autónoma de Occidente y Junta Local de Sanidad Vegetal, Valle del Fuerte, Sinaloa.

Agradecimientos. Los autores agradecen a productores de papa de Sinaloa y Sonora por su disposición para la realización de este trabajo.

Contribución de los autores. Los primeros cuatro autores contribuyeron con el trabajo de laboratorio, análisis e interpretación. El segundo autor fue responsable de la concepción experimental, escritura y revisión del escrito. Los autores quinto y sexto se responsabilizaron de la gestión de campo y muestreo.

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