El tabaco (Nicotiana tabacum) se cultiva en 124 países (http://tobaccoatlas.org/topic/growing/) y se considera un cultivo comercial importante para la economía agrícola de dichos países, particularmente en las naciones en desarrollo de Asia y África (Nowicki et al., 2022). Derivado de su uso principal que es la fabricación de cigarrillos y puros; entre otros, el cultivo de esta planta representa beneficios económicos y sociales generados tanto por las exportaciones de las mismas como por la creación de fuentes de trabajo tanto en el área rural como en la urbana. Debido a lo anterior, su producción es una actividad relevante en varias partes del mundo, como Brasil, China, EE. UU. e India (CONASAMA, 2023).

En México, el área de cultivo de tabaco se ha mantenido estable por una década. En 2008, se dedicaban 5,900 hectáreas para la siembra de este cultivo, el cual aumentó a 6,600 en el año 2018 (SIAP, 2023). En ese año, la producción de tabaco fue de 15,181 toneladas, incrementando en un 32 % con respecto al 2008 y ocupó la posición número siete entre los principales productores de América, por detrás de Brasil, Estados Unidos, Argentina, Cuba, Guatemala y Canadá. En 2019, el tabaco tuvo un incremento en su producción del 11 %, resultado de mayor rendimiento por parte de Nayarit, líder en producción de tabaco en México, en donde la mayor producción se obtiene durante el mes de mayo aportando alrededor de 43 % de la producción nacional anual. Cabe mencionar que, los agricultores en esta entidad, recibieron más de 37 mil 700 pesos mexicanos por tonelada (CONASAMA, 2023).

Al igual que otros cultivos, el tabaco es susceptible al daño por enfermedades causadas por patógenos infecciosos pertenecientes al grupo de los hongos y oomicetos. En este sentido, los oomicetos biotróficos de las plantas causan importantes problemas en la producción y pérdidas económicas en la agricultura moderna, ya que presentan una alta variabilidad genética y rápida adaptación para su sobrevivencia (Latijnhouwers et al., 2003).

Peronospora spp. normalmente se limitan a hospedantes específicos o a un número de hospedantes relacionados y son capaces de causar daños graves, son oomicetos biotróficos pertenecientes al filo Oomycota, tradicionalmente confundidos con hongos, pero filogenéticamente más cercanos a las algas. Se caracterizan por ser patógenos obligados que infectan principalmente plantas dicotiledóneas, mostrando un alto grado de especificidad por el hospedante. Estos organismos pueden causar enfermedades devastadoras, como los mohos azules, debido a su capacidad para esporular profusamente y completar ciclos infecciosos en cortos periodos bajo condiciones favorables (Lee et al., 2017). Se han reportado pérdidas económicas en cultivos ornamentales y cultivos alimenticios a nivel mundial y la enfermedad del mildiú velloso causada por este fitopatógeno se considera una de las enfermedades más importantes del cultivo de tabaco, ya que puede provocar graves pérdidas económicas (Thines y Choi, 2016). En Estados Unidos, la Peronospora tabacina incluso ha sido clasificada como una potencial arma biológica, ya que su presencia podría afectar gravemente la economía de este país en lo que respecta a la industria del tabaco (Thines y Choi, 2016). Entre los seis oomicetos biotróficos más importantes se menciona a P. tabacina, causante del moho azul del tabaco. Este oomiceto es un biótrofo obligado que requiere del tejido vivo del hospedante para completar su ciclo de vida (Perfect et al., 1999, Webster y Weber, 2007). El moho azul del tabaco es una enfermedad policíclica y en condiciones favorables para su desarrollo, el patógeno puede completar su ciclo de vida en 10 días o menos (Heist et al., 2002). El inóculo primario y secundario de P. tabacina consiste en esporangios asexuales, que normalmente son producidos en las hojas y tallos de plantas infectadas, observándose una esporulación activa en tejido foliar de hasta un millón de esporangios/cm², siendo este un factor importante que puede contribuir a la devastación completa de los cultivos de tabaco infectados. Los esporangios de este patógeno tienen la capacidad de viajar largas distancias y causar enfermedades a varios cientos de kilómetros de su lugar de origen (Heist et al., 2004; Spring et al., 2018).

Los síntomas que ocasiona P. tabacina comúnmente son lesiones o manchas amarillas en hojas de tabaco que aparecen individualmente o en grupos, y en muchas ocasiones se fusionan para formar áreas necróticas de color marrón claro. Algunas de las hojas presentan un moho velloso de color gris azulado en el haz, lo cual puede acompañarse de deformaciones hacia arriba. Cuando hay abundante esporulación, especialmente bajo condiciones de alta humedad relativa, el color azulado en las plantas enfermas se vuelve bastante llamativo, de ahí el nombre de la enfermedad: moho azul del tabaco (Borrás- Hidalgo et al., 2010). Dada la importancia de prevenir epidemias y pérdidas económicas ocasionadas por P. tabacina, resulta fundamental implementar estrategias de monitoreo que permitan una identificación temprana y confiable de posibles fenotipos de virulencia. Esto puede lograrse mediante la caracterización detallada de los atributos del patógeno que se correlacionan con su comportamiento infeccioso (Blanco-Meneses y Ristiano, 2011).

Conocer el proceso y las estrategias que utiliza P. tabacina para causar infección en las plantas de tabaco es de suma importancia, ya que algunas estrategias de ciertos patógenos están correlacionadas con la especificidad en el hospedante (Pring et al., 1995; Zhang et al., 2023), con lo cual determinar el proceso de infección proporcionaría herramientas útiles para un adecuado manejo de la enfermedad, al conocer el periodo en el que se desarrolla el patógeno en el hospedante. Actualmente se conoce poco sobre el proceso de patogénesis de P. tabacina, ya que los estudios disponibles se han centrado en aspectos generales de la infección, siendo escasos los análisis histológicos detallados en Nicotiana tabacum (Borrás-Hidalgo et al., 2010; Ayliffe et al., 2008); por lo tanto, el objetivo de este estudio fue describir los cambios histológicos que se presentan durante la infección de P. tabacina en plantas de tabaco inoculadas artificialmente.

Material vegetal e inóculo. Se utilizaron plantas sanas de tabaco de tres meses de edad, correspondientes al cultivar Tlapacoyan, las cuales fueron sembradas y mantenidas bajo condiciones controladas hasta su uso. El experimento se realizó en el laboratorio de Fitopatología del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, subsede Culiacán y se repitió en tres ocasiones independientes, durante los meses de enero de 2022, 2023 y 2024, respectivamente. Como inóculo se utilizó el aislado Pt1SA de P. tabacina, proveniente de San Andrés, Tuxtla, Veracruz, México, previamente caracterizado molecularmente mediante los oligonucleótidos específicos PTAB e ITS4 (Ramos-Barraza et al., 2023). La suspensión de esporangios se preparó a partir de hojas de plantas de tabaco previamente inoculadas y con esporulación activa, recolectando los esporangios con un pincel y ajustando la concentración a 1 x 10⁶ esporangiosporas mL^-1, utilizando una cámara de Neubauer para el conteo.

Inoculación de plantas de tabaco. La superficie del envés de 15 plantas de tabaco se desinfestó con etanol al 70 % por 1 min, se lavó con agua destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente. Se seleccionaron 10 sitios por hoja en cada planta de 1 cm² que fueron inoculados mediante la técnica de aplicación puntual con 10 µL de la suspensión de esporangiosporas. Como tratamiento testigo, se colocaron alícuotas de 10 µL de agua destilada estéril en cinco plantas de tabaco. Tanto las plantas de tabaco inoculadas como las plantas de tabaco testigo se colocaron en un invernadero tipo malla sombra a temperatura ambiente que varió en un rango de 15 a 17 °C y una alta humedad relativa (85-100 %), la cual se mantuvo de forma natural debido a las condiciones ambientales propicias para el desarrollo de la enfermedad.

De las plantas de tabaco, se realizaron cinco cortes de tejido (cada uno de 1 cm²) de los sitios inoculados a las 2, 4, 6, 9, 12, 18, 20, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 96, 120, 148, 172, 196 y 220 horas después de la inoculación (hdi), y se colocaron en casetes de plástico para su fijación. El esquema de muestreo propuesto, con intervalos más cortos en las primeras horas después de la inoculación y más amplios en etapas posteriores, fue diseñado para capturar las diferentes fases del proceso infeccioso de P. tabacina. Este enfoque permite observar eventos tempranos, como la germinación y penetración del patógeno, así como etapas posteriores, como la colonización y destrucción de tejidos. Las muestras se sumergieron en solución fijadora FAA (10 % formaldehido, 5 % ácido acético glacial, 50 % etanol al 96 %) durante al menos 24 h. Los tejidos se lavaron tres veces en etanol a 50 % durante 15 min cada uno, luego se deshidrataron gradualmente en una serie de etanol (50, 70, 96 y 100 %), transfiriéndose posteriormente a alcohol absoluto-xileno (1:1), dos cambios de xileno y dos cambios en parafina Paraplast (3 horas por cada paso de deshidratación). La inclusión de los tejidos consistió en embeber las muestras en moldes metálicos con parafina fundida orientándolas longitudinal o transversalmente para, posteriormente, realizar cortes en un micrótomo (Rojo-Báez et al., 2016; Cruz- Lachica et al., 2018).

Se cortaron secciones longitudinales y transversales de 10 µm de espesor en un micrótomo rotatorio Leica RM2125 RT (Leica Biosystems, Nussloch, Alemania) y fueron adheridas en portaobjetos previamente preparados con adhesivo Haupt y agua en un calentador de portaobjetos (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), a una temperatura de 40 °C durante 24 h para su secado. Posteriormente, se eliminó la parafina de los cortes mediante tres cambios de xileno (3 min en cada uno) y se hidrató con una serie gradual de alcohol etílico (100, 96, 70 y 50 %) por 3 min cada uno. La tinción en safranina al 1 % (preparada en alcohol etílico a 50 %) se realizó por 3 h. Después los cortes, se deshidrataron en una serie de alcohol etílico a 50, 70 y 96 % (3 min en cada uno) y tiñeron con verde rápido (Técnica Química®, México) al 1 % (preparada en alcohol etílico al 96 %) por 30s. Se lavaron y deshidrataron pasándolos por alcohol etílico al 96 y 100 %, por 3 min en cada uno. Finalmente, las secciones teñidas se sometieron a tres cambios de xileno (3 min en cada uno), se cubrieron con resina Entellan y los cubreobjetos se dejaron secar durante 24 h (Fierro-Corrales et al., 2015). Los preparados histológicos fueron observados en un microscopio óptico marca Carl Zeiss Imager A2 (Carl Zeis, Oberkochen, Alemania) con cámara integrada, para visualizar los daños en los tejidos en objetivos de 10, 20 y 40X.

Al inicio del experimento, se observaron las características anatómicas de las hojas sanas de tabaco, con el objetivo de establecer un punto de comparación con las estructuras infectadas. En los cortes histológicos transversales y longitudinales de las hojas sanas (Figura 1A y 1B), se identificaron las epidermis adaxial y abaxial, sin presencia de estructuras del patógeno ni signos de daño celular. Se observaron esporangios de P. tabacina sin germinar, adheridos en la superficie de la hoja entre las 2 y 48 hdi (Figura 1C y 1D). La adhesión de las esporas a las plantas hospedantes es esencial para el inicio de la enfermedad en las interacciones patógeno-planta (Perfect et al., 1999). El inicio de la germinación de los esporangios se observó a partir de las 96 hdi (Figura 2A) y el patógeno mostró la capacidad de formar apresorios melanizados en el extremo apical de los tubos germinativos de los esporangios de color café oscuro, de forma globosa a irregular (Figura 2B), mediante los cuales el patógeno se adhirió y penetró por aberturas naturales como lo son los estomas de las hojas (Figura 2A). La adhesión de los tubos germinativos y los apresorios a las superficies suele ser más fuerte que la de las esporas (Hardham, 2007).

Figura 1

Figura 2

La adhesión de los apresorios es particularmente fuerte para proporcionar una base firme para la penetración, lo que fue señalado por Pain et al. (1996), quienes indican que los fragmentos de la pared celular de los apresorios permanecen adheridos al sustrato después de la sonicación o agitación. La germinación directa de los esporangios ha evolucionado de forma independiente en varios géneros (por ejemplo, Peronospora). El modo de penetración del patógeno es tan diverso como el comportamiento del esporangio. Mientras que los oomicetos parásitos de las raíces suelen formar apresorios para invadir los tejidos internos penetrando directamente en las células rizodérmicas o apretándose entre la lámina media de las células (por ejemplo, Pythium, Aphanomyces, etc.), otras especies que atacan las hojas de forma similar (por ejemplo, Peronospora y Bremia), utilizan los estomas como puntos de entrada (Spring et al., 2018a), aunque también se ha documentado la penetración por otras aberturas naturales como los tricomas o pelos foliares (Agrios, 2005; Judelson y Blanco, 2005; Hardham, 2007; Latijnhouwers et al., 2003).

Después de la formación de los apresorios, se observó el desarrollo de las primeras hifas de infección, las cuales aparecieron entre las 96 y 120 hdi (Figura 2D). Estas hifas emergieron principalmente a través de aberturas naturales, como los estomas (Spring et al., 2018a), y también se observó la penetración de una espora por una apertura natural asociada a la base de un tricoma (Figura 2A), lo que sugiere que P. tabacina puede utilizar múltiples vías naturales de ingreso al tejido foliar (Agrios, 2005; Hardham, 2007). En este mismo intervalo se detectó la presencia de hifas secundarias invadiendo de forma intracelular las células epidérmicas, principalmente en la epidermis adaxial (Figura 2C). Este hallazgo coincide con lo reportado por Milholland et al. (1981), quienes mencionaron que, aunque P. tabacina se propaga predominantemente de manera intercelular a través del tejido vascular, también pueden observarse hifas intracelulares en vasos del xilema y células del parénquima.

Estos resultados demuestran que P. tabacina es capaz de invadir los tejidos de la hoja de tabaco tanto a nivel intercelular como intracelular, confirmando lo reportado por Milholland et al. (1981), sobre la presencia de hifas intercelulares en el xilema de plantas infectadas sistémicamente. Sin embargo, nuestros hallazgos amplían estas observaciones al evidenciar una invasión intracelular en el tejido vegetal, como el parénquima clorofílico y los haces vasculares, lo que sugiere una estrategia patogénica más agresiva durante las primeras etapas de infección. Este comportamiento ha sido respaldado por estudios genómicos y moleculares recientes, que destacan el avanzado repertorio de efectores y mecanismos de colonización de P. tabacina, facilitando su dispersión y establecimiento bajo condiciones ambientales específicas (Derevnina et al., 2015; Borrás- Hidalgo et al., 2010).

Entre las 168 y 192 hdi se observó el desarrollo de hifas primarias intracelulares (Figura 3A) e hifas secundarias cenocíticas colonizando el interior de los tejidos y provocando desorden celular y destrucción del parénquima lagunar, parénquima clorofílico y cloroplastos, haces vasculares y células epidérmicas de la hoja (Figura 3B- 5D). Durante la colonización de plantas hospedantes, los oomicetos patógenos presentan dos modos principales de nutrición: biotrofía, en la que los nutrientes se obtienen de las células hospedantes vivas, y necrotrofía, en la que los nutrientes se obtienen de las células hospedantes muertas que han sido atacadas por el oomiceto (Perfect et al., 1999). El patógeno en estudio, P. tabacina, pertenece a la familia Peronosporaceae, dentro de la cual se han desarrollado haustorios como una estructura celular especializada que penetra en la pared celular del hospedante, pero no altera el plasmalema (Agrios, 2005; Hardham, 2007). De este modo, las células vegetales afectadas permanecen vivas y su metabolismo apoya continuamente al patógeno. Este tipo de interacción es típico de los biótrofos como los mildius (Spring et al., 2018b).

Las plantas sanas de tabaco utilizadas para la inoculación con el patógeno (Figura 4A) y las plantas sin inocular utilizadas como testigos (Figura 4B) no presentaron síntomas durante el ensayo. En contraste, en las plantas inoculadas se observó la destrucción de los tejidos epidérmicos (Figura 3A), asociada con la aparición de manchas amarillentas irregulares en la superficie de las hojas (Figura 4C) y con la presencia de esporulación visible en el envés (Figura 4D). Entre las 192 y 216 hdi, el patógeno completó su ciclo de vida al producir oosporas y esporangios (Figura 3C), los cuales son la fuente de inóculo para nuevas infecciones. Las oosporas se forman en el interior de los tejidos de la hoja afectada cuando esta entra en contacto con el suelo. Al madurar, no germinan de inmediato, sino hasta después de la caída de la hoja. Estas estructuras pueden permanecer viables en el suelo y germinar en condiciones favorables para infectar plantas jóvenes. La formación de oosporas varía: en algunos casos es abundante, en otros su presencia es casi indetectable, probablemente debido a condiciones ambientales adversas. Se ha demostrado que las oosporas pueden sobrevivir durante largos periodos en el suelo, lo cual representa un reto para el manejo de las enfermedades causadas por oomicetos. Por ejemplo, en Plasmopara halstedii, agente causal del mildiu del girasol, las oosporas pueden mantenerse viables hasta por 10 años (Spring et al., 2018b).

Figura 3

En el caso de Phytophthora infestans, responsable del tizón tardío de la papa, se ha reportado que sus oosporas pueden conservar su infectividad hasta por 48 meses, dependiendo del tipo de suelo (Turkensteen et al., 2000). Asimismo, en Peronospora viciae f. sp. pisi, causante del mildiu del guisante, las oosporas mantuvieron una viabilidad superior al 25 % después de 29 semanas a bajas temperaturas (Inglis et al., 1997). Estos datos respaldan la capacidad de las oosporas para persistir en el ambiente, aún en ausencia del hospedante.

Figura 4

En el caso específico de P. tabacina, también se ha documentado la producción de oosporas como estructuras de supervivencia en el suelo, aunque su formación puede variar significativamente entre aislados y condiciones ambientales (LaMondia, 2010).

La detección temprana de esporangios y oosporas a las 96 hdi resulta relevante tanto desde el punto de vista biológico como fitosanitario, ya que indica el inicio de la fase reproductiva de P. tabacina antes de la manifestación de síntomas visibles. Su capacidad para completar parte de su ciclo de vida en un periodo relativamente corto enfatiza la importancia de implementar estrategias de monitoreo temprano en los cultivos de tabaco. La identificación oportuna de éstas estructuras reproductivas podría ser clave para aplicar tratamientos preventivos que limiten la propagación del patógeno y reduzcan el impacto de la enfermedad en el cultivo (Milholland et al., 1981; Borrás-Hidalgo et al., 2010; Derevnina et al., 2015).

En los cortes histológicos realizados en hojas de tabaco con síntomas visibles de la enfermedad causados por P. tabacina, se observó una alteración significativa en la arquitectura tisular, con presencia de micelio cenocítico intercelular e intracelular en el mesófilo, así como destrucción parcial de células del parénquima y tejidos vasculares (Figura 5A-D). Las hifas se distribuyeron ampliamente entre los espacios intercelulares del parénquima esponjoso y en algunos casos se observan estructuras de penetración que sugieren actividad invasiva. Estos hallazgos coinciden con lo reportado por Milholland et al. (1981), quienes describieron la colonización de P. tabacina en tejidos vasculares de plantas infectadas sistémicamente.

Figura 5

Esta destrucción celular generalizada no solo compromete la integridad del tejido vegetal, sino que también puede interferir con funciones esenciales como la fotosíntesis. La pérdida de organización celular observada en la epidermis, mesófilo y haces vasculares sugiere un deterioro en la capacidad de las hojas para llevar a cabo procesos fisiológicos clave. Este fenómeno es consistente con los mecanismos patogénicos descritos para otros oomicetos, como Phytophthora infestans, cuya invasión del tejido vegetal afecta directamente la función fotosintética (Latijnhouwers et al., 2003). En el caso de P. tabacina, la inducción de necrosis en las células del parénquima podría ser la causa principal de los síntomas foliares observados, como el amarillamiento y la muerte del tejido.

Las alteraciones histológicas observadas, como la destrucción de las células epidérmicas, la invasión del parénquima y la formación de estructuras reproductivas del patógeno dentro del tejido vegetal, tienen implicaciones fisiológicas significativas en las plantas de tabaco. La disrupción de la epidermis compromete la barrera protectora de la hoja, facilitando la pérdida de agua por transpiración y aumentando la susceptibilidad a otros patógenos. La colonización del parénquima, especialmente del mesófilo en empalizada, puede interferir con la fotosíntesis, debido a la reducción de células funcionales, la pérdida de cloroplastos y el colapso celular (Berger et al., 2007; Rojas et al., 2014). Estas modificaciones impactan directamente en la producción de fotoasimilados y, en consecuencia, en el crecimiento vegetal.

Asimismo, se ha reportado que la colonización de tejidos vasculares por especies de Peronospora interfiere en el transporte de agua y nutrientes, lo cual afecta la turgencia celular y el metabolismo general de la planta (Latijnhouwers y Govers, 2003). Estas alteraciones fisiológicas derivan en síntomas visibles como clorosis, necrosis y marchitez, que pueden culminar en la pérdida funcional del órgano afectado (Ah-Fong et al., 2019). Además, patógenos biotróficos como P. tabacina manipulan el metabolismo de la planta hospedante para favorecer su desarrollo, interfiriendo con rutas hormonales y señales de defensa, lo cual contribuye a un mayor deterioro funcional del tejido infectado (Dodds y Rathjen, 2010; Lorrain et al., 2003). En conjunto, estas evidencias refuerzan que las alteraciones estructurales observadas en este estudio no solo evidencian el avance del patógeno, sino que explican el deterioro fisiológico que compromete el rendimiento y la supervivencia de la planta. Dado el impacto significativo de P. tabacina en la fisiología de la planta y su capacidad para comprometer funciones esenciales, es fundamental establecer estrategias de manejo que reduzcan su propagación y efectos

adversos.

El conocimiento detallado sobre la patogénesis de P. tabacina obtenido en este estudio podría tener implicaciones significativas para el manejo integrado de plagas (MIP) en el cultivo de tabaco. Dado que el patógeno puede invadir los tejidos intracelularmente en las primeras 96 hdi, se recomienda un monitoreo intensivo durante las primeras etapas del cultivo, con el fin de detectar esporas y tomar medidas preventivas oportunas. Además, el uso de variedades resistentes podría desempeñar un papel clave en la reducción de la severidad de la enfermedad, lo que disminuiría la dependencia de tratamientos químicos (Rivas, 2012).

Este estudio también tiene implicaciones para la agricultura sostenible, ya que proporciona un enfoque más preciso sobre cómo P. tabacina infecta y afecta los cultivos de tabaco. El entendimiento detallado de la patogénesis y la dinámica de la infección permite a los agricultores implementar prácticas de manejo más eficaces, con menos dependencia de productos químicos. Además, el uso de técnicas de manejo biológico y la selección de variedades resistentes pueden contribuir a un control más sostenible de la enfermedad, reduciendo el impacto ambiental y mejorando la rentabilidad del cultivo a largo plazo (Blanco Marquizo et al., 2022; Singh et al., 2019).

Este estudio permitió describir los cambios histológicos durante la infección de Peronospora tabacina en plantas de tabaco inoculadas artificialmente, proporcionando evidencia de su capacidad para infectar de manera intercelular e intracelular a su hospedante. Se observaron síntomas en hojas de tabaco a las 168 h después de la inoculación, mientras que la producción de esporangios y oosporas ocurrió desde las 96 h, completando su ciclo de vida en ese periodo. Estos hallazgos contribuyen al entendimiento del proceso de patogénesis de P. tabacina, complementando los estudios previos sobre infección y ofreciendo información relevante para el desarrollo de estrategias de manejo de la enfermedad.