Viroma del nopal verdura en la zona centro de México

Materiales y Métodos

Secuenciación de alto rendimiento (HTS). Dos muestras que mostraban síntomas putativos a virus, denominadas CDMX-1 y EM-1 se sometieron a HTS. CDMX1 estuvo conformada con cladodios (n=4) que presentaban patrones amarillos irregulares, anillos amarillos y mosaico, procedentes de la alcaldía Milpa Alta de la Ciudad de México (Figura 1A-D); la muestra EM-1 (n=1) fue una planta proveniente de Oxtotipac, Municipio de Otumba, con manchas cloróticas alrededor de las espinas, este síntoma se denomina localmente por los productores “pinto” (Figura 1E). En ambos casos, se extrajo ARN con el kit SV Total RNA Isolation System (Promega, USA), siguiendo las instrucciones del fabricante. La muestra EM-1 se envió a Macrogen Inc. (Corea) en donde se preparó la librería usando TruSeq stranded total ARN, tratado previamente con Ribo-Zero Plant. La secuenciación se realizó en un equipo Illumina NovaSeq6000, con 150-bp PE. La muestra CDMX-1 se envió a BGI Genomics (China), donde se construyó la librería Eukaryotic Strand-specific mRNA y la secuenciación se realizó en la plataforma DNBSEQ, con 150-bp PE.

Análisis bioinformático. Los adaptadores y las secuencias de baja calidad de los datos obtenidos de Macrogen fueron removidos usando Fastp (Chen et al., 2018). Por su parte, las secuencias de BGI, se recibieron limpias y sin adaptadores, por lo cual se verificaron en FastQC (Andrews, 2010). Las lecturas limpias fueron ensambladas de novo con el software SPAdes (Prjibelski et al., 2020). Los contigs obtenidos fueron sometidos a una búsqueda BLASTx y BLASTn en una base de datos local de virus/viroides. Posteriormente, la lista reducida de hits virales se comparó con la base de datos completa no redundante (nr) del GenBank utilizando BLASTx y BLASTn (Vučurović et al., 2021).

Para la reconstrucción de los genomas, se utilizó Bowtie2 (Langmead y Salzberg, 2012), Samstools (Li et al., 2009) e Integrative Genomic Viewer (IGV) versión 2.3 (Thorvaldsdóttir et al., 2013). Las características del ensamble de los genomas obtenidos se obtuvieron en Qualimap (Okonechnikov et al., 2016), donde se calculó la cobertura promedio por nucleótido de cada genoma. Finalmente, los genomas obtenidos se anotaron con ORFinder del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (por sus siglas en inglés, NCBI) y se depositaron en el GenBank.

Análisis filogenético. Los genomas obtenidos se alinearon con especies representativas del género Tobamovirus obtenidas en la base de datos del NCBI. Se utilizó el modelo GTR+F+R5 de sustituciones de nucleótidos. Por otro lado, se elaboró un árbol filogenético alineando secuencias de genomas completos de miembros representativos del género Carlavirus (familia: Betaflexiviridae), obtenidos del NCBI, así como un aislamiento del virus obtenido en este estudio. El modelo evolutivo estimado fue GTR+F+R5. Para el caso de nuevos virus, se construyeron dos árboles filogenéticos alineando secuencias de aminoácidos de la replicasa viral y de la cápside proteica pertenecientes a diferentes especies de la familia correspondiente obtenidas del ICTV (Kreuze et al., 2020) y la secuencia obtenida en este estudio. El modelo evolutivo para la replicasa viral fue LG+F+R7 y para la cápside proteica LG+F+R5. Para el análisis filogenético del nuevo viroide, se utilizaron secuencias de especies representativas de ambas familias de estos patógenos obtenidas del NCBI y el modelo evolutivo utilizado fue HKY+F+G4.

En todos los casos, los árboles se generaron con el método de Máxima Verosimilitud utilizando IQTREE 2 (Minh et al., 2020), el alineamiento múltiple de secuencias en MAFFT (Katoh et al., 2019), y el modelo evolutivo según el Criterio de Información Bayesiano implementado en ModelFinder (Kalyaanamoorthy et al., 2017). El soporte nodal se estimó con el bootstrap ultrarrápido (UFBoot) ejecutando un total de 1000 réplicas. Finalmente, la visualización y edición de los árboles se realizó en iTOL (Letunic y Bork, 2021).

Análisis de identidad por pares. Para reforzar la clasificación de las nuevas especies, se estimó la identidad por pares con SDT v1.2 (Muhire et al., 2014) comparando la replicasa y cápside proteica de los virus más cercanos, así como de diferentes genomas de la familia Pospiviroidae para el caso del viroide.

Predicción de estructura secundaria del nuevo viroide. Se obtuvo utilizando el servidor web UNAFold (www.mfold.org consultada el 18 de noviembre de 2022) (Zuker, 2003).

Validación de la detección de los nuevos virus y viroide. Parte del ARN extraído de los cladodios con síntomas que se envió a HTS, se sometió a RT-PCR para confirmar la presencia del viroide y virus encontrados. Se diseñaron diferentes iniciadores (Cuadro 1) a partir de las secuencias obtenidas. Adicionalmente, se realizaron análisis de RT-PCR para la detección de uno de los virus en cuatro muestras independientes recolectadas en la Ciudad de México (n=1, asintomática), Estado de México (n=2), Hidalgo (n=2) y Morelos (n=2).

En todos los casos, la síntesis de cADN se realizó con la enzima M-MLV Reverse Transcriptase (200 U μL -1) (Promega, USA) a partir de 1 μL de ARN total y 1 μL (10 mΜ) del iniciador antisentido, siguiendo las instrucciones del fabricante. El cADN obtenido se utilizó como cadena molde para la PCR cuya mezcla consistió en 2 μL de amortiguador de reacción (5X Green GoTaq®), 0.6 μL de MgCl2 (25 mM), 0.2 μL de dNTPs Mix (10 mM), 0.6 μL (10 μM) de cada iniciador, (sentido y antisentido) 4.9 μL de agua ultrapura, 0.1 μL de GoTaq® DNA Polymerase (5 U μL -1) (Promega, USA) y 1 μL de cDNA en un volumen final de 10 μL. Las

Detección de CCV-1. Se analizaron mediante RT-PCR 129 muestras provenientes de cladodios recolectados del Estado de México, Hidalgo, Morelos y Ciudad de México para la detección de CCV-1 con los oligonucleótidos CCV1-F/R con la finalidad de conocer su presencia o ausencia.

Microscopía electrónica de transmisión. Con el propósito de conocer si se encontraban viriones de los virus determinados en los resultados de HTS, plantas de nopal sintomático fueron utilizadas para preparar rejillas de cobre de 300 mallas cubiertas con Formvar para su observación. Para esto, se realizó la técnica “leaf dip” y se utilizó ácido fosfotúngstico 2 % como contrastante. Las rejillas se observaron en un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2 Spirit TWIN, de la Unidad de Microscopía Electrónica del Colegio de Postgraduados.

Resultados

Detección de virus por HTS. Se obtuvieron 32,921,232 lecturas en la muestra EM-1 y 48,292,940 lecturas para la muestra CDMX-1. Las lecturas sin procesar se depositaron en el NCBI con el número de bio-proyecto PRJNA922236. El análisis de estas lecturas mostró la presencia de secuencias de diferentes virus y un viroide en nopal ((Cuadro 2), los cuales se describen a continuación:

Opuntia virus 2. Se detectó y confirmó su presencia en las dos muestras sometidas a HTS, obteniendo dos genomas completos denominados OV2-Edo-Mex y OV2CDMX; la cobertura promedio por nucleótido fue de 634,104.1X y 500.5X, respectivamente (Figura 2A, 3A). El genoma OV2-Edo-Mex de 6,453 nt tiene la organización típica de los tobamovirus (Figura 2B) con una región no traducible (UTR) 5’ (nt 1-57), un marco de lectura abierto (ORF) que codifica la replicasa viral (RdRp) de 183 kDa (nt 58 -4,854), metiltransferasa/helicasa de 128 kDa (nt 67-3,360), una proteína de movimiento (MP) (nt 4,844-5,608), cubierta proteica (CP) (nt 5,514-6,167) y la UTR 3’ (nt 6,168-6,453). El genoma de OV2-Edo-Mex tiene una identidad de nucleótidos del 97.6 % con el aislamiento NC_040685.2 de OV2 (Cuadro 2).

El genoma del aislamiento OV2-CDMX tuvo una longitud de 6,453 nt, con una organización típica de tobamovirus (Figura 3B) consistente en una región 5’ no traducible (nt 1-61), un ORF que codifica la RdRp de 183 kDa (nt 62-4,858), metiltransferasa/helicasa de 128 kDa (nt 62-3,364), MP (nt 4,848-5,612) y CP (nt 5,632-6,171) así como una UTR 3’ (nt 6,172-6,453). La secuencia del genoma de este aislamiento compartió una identidad de nucleótidos del 97.61% con el aislamiento NC_040685.2 de OV2 (Cuadro 2). El análisis filogenético ubicó a ambos

aislamientos de OV2 obtenidos en este estudio, en el subgrupo de tobamovirus que infectan cactáceas (Figura 4).

Cactus carlavirus 1 (CCV-1). Este virus se detectó en las dos muestras que se sometieron a HTS. Sin embargo, el genoma completo solo se recuperó en la muestra del Estado de México. El genoma obtenido estuvo soportado por una cobertura promedio por nucleótido de 15,516X (Figura 5A). La organización del genoma de CCV-1 es similar a la de otros carlavirus conocidos, con seis ORFs (Figura 5B): el ORF1 (nt 61-5,880) codifica una poliproteína (220 kDa) involucrada en la replicación viral; ORF2 (TGB1) (nt 5,910-6,599), ORF3 (TGB2) (nt 6,577-6,897) y ORF4 (TGB3) (nt 6,879-7,067) codifican tres proteínas de 26 kDa, 11 kDa y 7 kDa, respectivamente, que son las proteínas del triple bloque de genes (TGB) asociadas al movimiento de célula a célula ‘tipo potex’ (Morozov y Solovyev, 2003); ORF5

(nt 6,866-8,011) codifica una proteína con un dominio de cubierta proteica (CP) típica de carlavirus y un dominio Flexi_CP; ORF6 (nt 8,004-8,324) codifica una proteína de unión a ácidos nucleicos (NB) de 12 kDa; y por último las regiones UTR 5’ (nt 1-60) y 3’ (8,325-8,395). El análisis filogenético agrupó al CCV-1-EdoMex, junto a los dos únicos genomas que se tienen disponibles en el GenBank de este virus (Figura 6) con un porcentaje de similitud a nivel de nucleótidos del 87.86 y 90.41 %.

Opuntia potexvirus A (OPV-A). En la muestra compuesta de la Ciudad de México se detectó un contig de 6,671 nt, que en la búsqueda BLASTx tuvo 77.5 % de identidad con Schlumbergera virus X (SchVX). La inspección adicional de la transcripción del genoma viral y la curación mediante el mapeo interactivo de las lecturas filtradas dio como resultado una secuencia viral consolidada de 6,644 nt respaldada por 10,536,601 lecturas con una cobertura promedio por nucleótido de 238,206.9X (Figura 7A). El genoma se encuentra organizado en cinco ORFs (Figura 7B). Al igual que otros potexvirus, el ORF1 (nt 85-4737) codifica la replicasa viral

que consta de 1,550 aminoácidos (aa). Asimismo, posee un conjunto de tres ORFs parcialmente superpuestos: ORF2 (4,737-5,426 nt), ORF3 (5,389-5,721 nt) y ORF4 (5,651-5,842 nt), que muestran la configuración típica del bloque de tres genes (TGB) de los potexvirus. El ORF5 (5,854-6,531 nt) codifica la proteína de la cápside (CP). Finalmente, se detectaron las regiones UTR de 84 y 113 nt en los extremos 5’ y 3’, respectivamente.

Los motivos conservados de aa QDGAML, HQQAKDE y TFDANTE se identificaron en la región C-terminal de la replicasa viral (Van der Vlugt y Berendsen 2002). Por otra parte, un dominio replicasa catalítico, que contiene el motivo central de consenso característico TGX3TX3NTX22GDD encontrado en potexvirus (Martelli et al., 2007), estaba presente cerca del extremo C de la replicasa. También, se encontró el motivo hexanucleótido 5’-GGAAAA-3’, en el extremo 5’-

UTR, el cual se tiene presente en algunos potexvirus (Chen et al., 2005), al igual que una putativa señal de poliadenilación en el extremo 3’-UTR.

La comparación por pares reveló identidades a nivel de aminoácidos que oscilaron del 59.8 al 82.2 % para la CP, y del 53.6 al 77.7 % para la replicasa viral (Figura 8a, b). El criterio de demarcación de especies para potexvirus, establece que especies distintas tienen <72 % nt o <80 % aa de identidad para los genes de la replicasa o cubierta proteica, respectivamente (Adams et al., 2004). Por lo anterior, el virus detectado en nopal se considera una nueva especie del género Potexvirus para el cual se propone el nombre de “Opuntia potexvirus A” (OPV-A). La secuencia del genoma de OPV-A se depositó en el GenBank con el número de acceso OQ240443. Los árboles filogenéticos basados en secuencias de aminoácidos de la replicasa viral y cubierta proteica de los virus pertenecientes a la familia Alfaflexiviridae muestran que OPV-A se agrupa con los potexvirus: Pitaya virus X (PiVX), Zygocactus virus X (ZyVX), Cactus virus X (CVX), SchVX y Opuntia virus X (OpVX), en un clado altamente respaldado (Figura 9 y 10).

Opuntia viroid I. En la muestra CDMX-1 se encontró un contig similar al de los viroides de la familia Pospiviroidae, al cual se denominó “Opuntia viroid I” (OVd-I). Los resultados del análisis BLASTn mostraron una similitud con Columnea latent viroid-B, con 14 % de cobertura de consulta y un E value = 4e-08. Para determinar el género al que pertenece el OVd-I, se realizó la inspección manual y curado de la secuencia. Se obtuvo un contig final de 412 pb con el cual se realizó un mapeo en los datos de HTS corroborando su presencia, con una cobertura promedio por nucleótido de 1,492X. La confirmación de OVd-I se realizó por RT-PCR y secuenciación Sanger.

La predicción de la estructura secundaria del OVd-I, mostró una molécula en forma de bastón con una región central conservada (CCR) (Figura 11), criterio principal para clasificar a un viroide como nuevo miembro de la familia Pospiviroidae. La presencia de la CCR y de una región conservada terminal (TCR) se tomaron en

cuenta para ubicar al OVd-I dentro del género Apscaviroid (Di Serio et al., 2014). En la TCR no se detectaron cambios; sin embargo, en la CCR superior se detectaron cinco cambios (T/G,T/C,T/G,A/G,G/C) y en la CCR inferior se detectaron seis cambios (G/T,T/C,G/C,C/A,G/C,A/C) debidos probablemente a la divergencia del OVd-I con el género Apscaviroid.

Los resultados del análisis filogenético de Máxima Verosimilitud (Figura 12) ubicaron al OVd-I en el clado del género Apscaviroid de la familia Pospiviroidae. El análisis SDT, basado en comparaciones por pares, muestra que ninguna de las secuencias de viroides analizadas presenta más del 80 % de similitud con el genoma de OVd-I (Figura 13). Finalmente, OVd-I se detectó en las cuatro muestras independientes de la Ciudad de México y en una muestra de Morelos.

Otros virus detectados. Adicionalmente, en la muestra CDMX-1 se detectaron contigs virales adicionales (Cuadro 3). Sin embargo, solo se confirmó un caulimovirus y un vityvirus por RT-PCR. Por lo tanto, es necesario continuar con trabajos adicionales que permitan recuperar los genomas completos de estas potenciales nuevas especies de virus.

Detección de CCV-1. Se detectó en las cuatro entidades en estudio en el 72 % de muestras analizadas (Cuadro 4); se trata del primer reporte de la presencia de CCV1 en plantaciones comerciales de nopal verdura en México.

Microscopía electrónica. En las muestras analizadas se observaron viriones de diferentes tamaños y formas (Figura 14). Se observaron partículas en forma de varilla rígida de aproximadamente 300 nm de longitud y 18 nm de diámetro, típicas de tobamovirus. Asimismo, se encontraron viriones en forma de varilla flexible, con una longitud promedio de 700 nm y 15 nm de diámetro, las cuales podrían pertenecer al CCV-1. También se observaron partículas virales flexibles de aproximadamente 500 nm de longitud.

Discusión

En los últimos años, la secuenciación de alto rendimiento (HTS) ha permitido el descubrimiento de nuevas especies virales (Maliogka et al., 2018; Villamor et at., 2019), y con ello también se ha evidenciado la complejidad de los viromas (Al Rwahnih et al., 2011; Vučurović et al., 2021).

En México se han realizado investigaciones para conocer los virus asociados al nopal con síntomas putativos a virosis. Sin embargo, con el uso de técnicas

especies para este género (Jan et al., 2020). Los potexvirus tienen partículas elongadas de aproximadamente 700 nm de longitud, infectan hospedantes herbáceos, no tienen vectores conocidos y se trasmiten principalmente de manera mecánica (Jan et al., 2020). Filogenéticamente el OPV-A se encuentra estrechamente relacionado con PiVX y SchVX que infectan naturalmente cactáceas (Figura 9 y 10).

Recientemente, en cactáceas ornamentales se reportaron los potexvirus CVX, OpVX, PiVX, SchVX y ZyVX, en infección única o mixta, de hasta cuatro de ellos (CVX, PiVX, SchVX y ZyVX) en una planta (Park et al., 2021). Adicionalmente

convencionales como RT-PCR, ELISA, microscopía electrónica de transmisión e indexado biológico, en varias investigaciones no fue posible determinar al (los) virus asociado(s), debido a las características y limitaciones que presentan estas técnicas (De La Torre-Almaraz et al., 2007; De La Torre-Almaraz et al., 2016a; De La Torre-Almaráz et al., 2016b; Alonso-Barrera et al., 2015). Con el uso de HTS es posible determinar la presencia de todos los virus (conocidos o desconocidos) en una muestra, característica que otras técnicas no poseen. Así, por ejemplo, con esta técnica se logró la detección de un nuevo tobamovirus (OV2) en una muestra compuesta de ARN extraído de O. ficus-indica y O. albicarpa recolectadas en el Estado de México (Salgado-Ortíz et al., 2020).

En este estudio se conoce por primera vez el viroma del nopal verdura cultivado en la zona centro de México, constituido por tres virus (dos nuevos, del género Potexvirus y Carlavirus) y un viroide (género Apscaviroid).

Opuntia potexvirus A (OPV-A) se propone como un nuevo miembro de la familia Alphaflexiviridae, género Potexvirus, con base en los criterios de demarcación de

se informó que la cactácea Notocactus leninghausii f. cristatus, puede estar coinfectada hasta con seis virus, cuatro potexvirus (CVX, PiVX, SchVX y ZyVX) y dos tobamovirus (CMMoV y RCNaV) (Park et al., 2018). Estos reportes muestran que las cactáceas son hospedantes naturales de los potexvirus y tobamovirus. Sin embargo, los síntomas que causan de manera individual aún no se han descrito claramente ni se conoce su gama de hospedantes. Por lo anterior, en estudios posteriores tendrá que abordarse la caracterización biológica del potexvirus detectado en este estudio, para determinar, entre otras cosas, si representa un riesgo para la producción de nopal en México.

En el análisis de HTS, el CCV-1 se detectó en las muestras de la Ciudad de México y del Estado de México. Sin embargo, el genoma completo solo se recuperó en los cladodios recolectados en este último. La detección del genoma parcial en la muestra de la Ciudad de México, probablemente se deba a que el OPV-A y el OV2 suprimieron la replicación del CCV-1, por lo tanto, el número de secuencias obtenidas para este virus no cubrió la totalidad del genoma. El CCV-1 aislado del Estado de México, se agrupó en el mismo clado del aislamiento MK415316.1 reportado en Estados Unidos y una secuencia de México (KU854930.4) pero en una rama distinta. Este virus se detectó en las cuatro entidades muestreadas (Cuadro 4) tanto en plantas con síntomas de virosis como en plantas asintomáticas, en este último caso solamente en los estados de Hidalgo, Morelos y Ciudad de México. Se sabe que los carlavirus se transmiten por pulgones de forma no persistente, o por moscas blancas, infectan predominantemente plantas herbáceas y muchos de ellos causan infecciones latentes o asintomáticas, lo cual explicaría su detección en plantas de nopal que no presentaban alteraciones visibles (Kreuze et al., 2012). Los virus CCV-1 y cactus carlavirus 2 (CC-2), se detectaron por primera vez en una planta asintomática del híbrido ‘Professor Ebert’ de Epiphyllum spp. (Peng et al., 2019). Por lo tanto, en posteriores estudios, será necesario investigar el comportamiento biológico de ambos virus para determinar si bajo ciertas condiciones ambientales inducen algún síntoma en nopal y otras plantas de importancia económica. Asimismo, tendría que determinarse si constituyen un riesgo para la producción de nopal o algún otro cultivo.

El OV2 se reportó por primera vez en México en diferentes especies de cactáceas cultivadas. (O. ficus-indica y O. albicarpa) y no cultivadas (O. pilifera, O. depressa, O. tomentosa, O. robusta y O. streptacantha) del Estado de México, Puebla y Ciudad de México (Salgado-Ortíz et al., 2020). El género Tobamovirus se divide en siete grupos, de acuerdo con su hospedante natural, que incluye a las familias Solanaceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Malvaceae, Cactaceae, Passifloraceae, Apocynaceae y Leguminosae (Li et al., 2017; Song et al., 2006). El análisis filogenético fue consistente con esta división, agrupando al OV2 en el clado de tobamovirus que infectan cactáceas (Figura 4). Otro tobamovirus reportado en México que infecta nopal es el Rattail cactus necrosis-associated virus (RCNaV). Este virus se reportó en la zona de Axapusco, Otumba, y San Martín de las Pirámides, Estado de México en plantas de nopal que mostraban anillos amarillos pequeños, (De La Torre-Almaráz et al., 2016a). Sin embargo, en este estudio no se detectó al RCNaV en ninguna de las muestras analizadas por HTS.

En la presente investigación se informa por primera vez a nivel mundial, la presencia de un viroide en nopal (OVd-I). Sin embargo, debido a que éste se encontró en muestras con infecciones mixtas con OV2, CCV-1 y OPV-A, se desconoce si provoca o no síntomas de manera individual.

Hasta ahora en México no existe una normatividad que regule el movimiento de material propagativo de nopal, por lo que existe el riesgo de la introducción de los virus y viroide encontrados en esta investigación a nuevas zonas productoras de esta especie.

Conclusiones

El viroma del nopal verdura en cuatro zonas productoras del centro de México estuvo conformado por Opuntia virus 2 (género Tobamovirus), Cactus carlavirus 1 (Género Carlavirus), un nuevo virus cuyo nombre propuesto es Opuntia potexvirus A (Género Potexvirus) y un nuevo viroide que se propone nombrar Opuntia viroid I (Género Apscaviroid). Cactus carlavirus 1 se encontró en los cuatro estados productores de nopal muestreados