Introducción

Introducción

El género Orthotospovirus (familia Tospoviridae, orden Bunyavirales) (Kuhn et al., 2022) representa un grupo emergente de virus con una distribución global que afecta a diversas especies de plantas (Pappu et al., 2009). Los miembros de este género han ampliado su distribución o ámbito de hospederos vegetales (Londoño et al., 2012; Naidu et al., 2005; Webster et al., 2015). Varias especies de orthotospovirus son reconocidas como patógenos vegetales económicamente significativos, limitando la producción de cultivos o afectando la calidad del rendimiento. Por ejemplo, diversos informes mencionan pérdidas de rendimiento de hasta el 100 % y pérdidas económicas que oscilan entre decenas de miles hasta millones de dólares estadounidenses (Daughtrey et al., 1997; Hasegawa y Del Pozo-Valdivia, 2023; Mandal et al., 2012).

El género Orthotospovirus comprende 26 especies aceptadas (Kuhn et al., 2022). El virus de la marchitez manchada del jitomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV) es la especie tipo y ocasiona un alto impacto económico en diversos cultivos (Pappu et al., 2009). Otra especie significativa dentro del género es el virus de la mancha necrótica del impatiens (Impatiens necrotic spot virus, INSV) (Daughtrey et al., 1997). Históricamente, INSV fue inicialmente reconocido como un serotipo distinto de TSWV, identificado como TSWV-I (De Ávila et al., 1992). También es destacable el virus de la mancha amarilla del iris (Iris yellow spot virus, IYSV), un orthotospovirus de origen eurasiático que se ha convertido en una limitación en la producción de bulbos y semillas de cebolla, extendiéndose rápidamente por todo el mundo (Bag et al., 2015; Gent et al., 2006).

A pesar de la extensa investigación sobre la biología, manejo e interacción de los orthotospovirus con los trips vectores (Montero-Astúa et al., 2016), la información sobre la ocurrencia y los datos de secuencias es bastante limitada en todos los países de América Central. En Costa Rica, durante principios de la década de 1990, TSWV e INSV (entonces TSWV-I) fueron identificados mediante serología en plantas de impatiens (Impatiens spp.) y lisianteo (Eustoma sp.) (Hsu y Lawson, 1991; Rivera et al., 1990). IYSV fue reportado en Guatemala (Nischwitz et al., 2007) y Costa Rica (Montero-Astúa et al., 2017). Además de estas publicaciones científicas, se encontró información (publicaciones locales, tesis o informes de proyectos institucionales disponibles en línea) sobre la presencia de TSWV en Guatemala y Honduras (Cumes Mantanico, 2008; Dardón et al., 1994; Doyle et al., 2002; Espinoza Rivera, 2012; Palmieri, 2012), aunque no se hallaron datos de secuencias de aislamientos de TSWV de América Central en bases de datos públicas.

A diferencia de la situación en América Central, varios informes han actualizado la presencia de orthotospovirus en las islas del Caribe. Se han registrado brotes del virus de la mancha clorótica del jitomate (Tomato chlorotic spot virus, TCSV), una especie diferente de orthotospovirus descrita originalmente en Brasil (De Ávila et al., 1993), en toda la cuenca del Caribe: Cuba (Martinez-Zubiaur et al., 2016), República Dominicana (Almeida et al., 2014; Batuman et al., 2014), Haití (Adegbola et al., 2016), Puerto Rico (De Jensen y Adkins, 2014; Webster et al., 2013); y adicionalmente en Florida (EE.UU.) (Londoño et al., 2012; Webster et al., 2015). Además, se confirmó la presencia de TSWV mediante RT-PCR en la República Dominicana en 2013 (Martínez et al., 2014).

La obtención de datos de secuencias de orthotospovirus es esencial en todas las regiones geográficas y en diversos hospederos vegetales por tres razones fundamentales: (i) analizar la diversidad viral a nivel global, (ii) identificar aislamientos genéticamente distintos y (iii) contribuir a la comprensión epidemiológica. Esta información resulta crítica para los programas de mejora de cultivos y de resistencia a enfermedades. Por ejemplo, existen aislamientos de TSWV que pueden superar la resistencia conferida por los genes Sw-5 y Tsw en plantas de tomate (Solanum lycopersicum) y pimiento (Capsicum annuum), respectivamente. Conocer los aislamientos presentes en una zona y realizar comparaciones de secuencias para identificar las mutaciones que permiten romper la resistencia son aportes vitales para los programas de mejora genética (Batuman et al., 2017; Sharman y Persley, 2006). En este contexto, el objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de los orthotospovirus en Costa Rica y obtener secuencias parciales del genoma para analizar la variabilidad genética. Esta información actualiza la presencia y variabilidad de estos virus vegetales en América Central. Llevamos a cabo un estudio mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA) de plantas con síntomas similares a los causados por virus, con el fin de aumentar las posibilidades de detectar orthotospovirus. Un subconjunto de muestras positivas en ELISA fue posteriormente examinado mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

No se detectaron plantas positivas para TSWV en nuestras muestras. Por lo tanto, también realizamos un análisis longitudinal de la detección de TSWV e INSV en Costa Rica basado en informes del diagnóstico clínico del Laboratorio de Patógenos Vegetales Obligatorios y sus Vectores (LaFOV), Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, disponibles desde el año 2000. Este estudio proporciona una actualización fundamental sobre la presencia y variabilidad de los orthotospovirus en Costa Rica, contribuyendo a una comprensión más amplia de estos virus en América Central. Los hallazgos sugieren un cambio en la prevalencia de los virus y destacan la importancia de mantener una vigilancia y una investigación continuas. Los esfuerzos futuros deben centrarse en estudios detallados de vigilancia y genéticos para gestionar de manera más efectiva estos virus vegetales y abordar los desafíos agrícolas.

Materiales y Métodos

Materiales y Métodos

Metodología de recolección de muestras. Recopilamos un total de 295 muestras de plantas que representan 20 familias botánicas diferentes (como se detalla en el Cuadro 1). Estas muestras se obtuvieron de 47 ubicaciones independientes, que incluyeron campos, invernaderos, parques y jardines en cinco de las siete provincias de Costa Rica. Nuestros objetivos principales para el análisis mediante Ensayo Inmunoenzimático (ELISA) fueron INSV, IYSV, TSWV y el serogrupo compuesto por el virus del anillo de la mancha del maní (GRSV) y el virus de la mancha clorótica del tomate (TCSV). El período de recolección abarcó desde 2013 hasta 2014, y las muestras se obtuvieron principalmente de agricultores que las enviaron al laboratorio de diagnóstico debido a la manifestación de síntomas virales en sus plantas. Además, se realizaron visitas proactivas a campos, invernaderos, jardines o parques con antecedentes conocidos de ocurrencia de orthotospovirus o informes de plantas sintomáticas. Los síntomas observados que motivaron la recopilación de muestras incluyeron patrones de mosaico, anillos concéntricos o líneas cloróticas o necróticas, deformación de hojas, superficie irregular de hojas o frutos (como ampollas o arrugas) y enanismo. En nuestro proceso de selección, se prestó especial atención a especies de plantas conocidas como hospederas de estos virus, como tomates, cebollas y pimientos. Estos cultivos hortícolas estuvieron más representados en nuestro conjunto de muestras debido a su importancia agrícola y a la mayor probabilidad de detectar los virus de interés en ellos. Además de éstos, también se incluyeron en nuestro estudio plantas ornamentales y diversas especies hortícolas para ofrecer una visión integral de la presencia y diversidad de orthotospovirus en Costa Rica.

Familia de planta N° muestras / provinciaz Total muestras N° Sitios IDs muestras Tejido
Amaryllidaceae 2 A, 23 C, 17 SJ 42 13 T161-T163, T170-T175, T177-T180, T182, T183, T192, T195-T199, T283-T285, T288-T296, T298-T301, T305, T316, T317, T321 Hoja
Anacardiaceae 1 SJ 1 1 T335 Fruto
Apocynaceae 1 A, 5 C 6 3 T076, T159, T241, T346-T348 Hoja
Asparagaceae 1 A 1 1 T329 Hoja
Asteraceae 0.25 6 2 T051, T053, T325-T328 Hoja
Balsaminaceae 4 A, 3 C 7 2 T028-T031, T061, T261, T262 Hoja
Caricaceae 5 P 5 1 T330-T334 Fruto
Cucurbitaceae 7 A, 3 C, 1 G, 9 P 20 8 T035-T037, T046-, T047, T080, T090, T091, T160, T268, T270, T280, T135-T140, T265, T266 Hoja
Fabaceae 4 A, 2 C, 1 SJ 7 5 T034, T079, T118, T124, T148, T243, T258 Hoja
Gentianaceae 3 C 3 1 T322-T324 Hoja
Iridaceae 4 C 4 1 T184-T187 Hoja
Lamiaceae 3 C 3 1 T156-T158 Hoja
Liliaceae 2 C 2 1 T188-T189 Hoja
Malvaceae 3 A, 1 G, 1 SJ 5 3 T066-T068, T081, T350 Hoja
Orchidaceae 18 A, 27 C 45 2 T012-T027, T055, T056, T214-T240 Hoja
Oxalidaceae 2 A 2 1 T120, T121 Hoja
Plantaginaceae 2 C 2 1 T057, T058 Hoja
Rosaceae 2 A 2 1 T128, T131 Hoja
Solanaceae 71 A, 37 C, 11 P, 12 SJ 131 T001-T011, T032, T033, T038-T045, T048-T050, T054, T059-T060, T062-T065, T069-T075, T077, T078, T082-T089, T092-T104, T106-T112, T114-T116, T119, T122, T134, T165-T169, T176, T181, T194, T202-T205, T209-T213, T245-T251, T253, T263, T264, T267, T271-T279, T302-T304, T306-T313, T320, T336-T338, T341-T345 Hoja y/o Fruto
Zingiberaceae 1 A 1 1 T339 Hoja
Cuadro 1: Muestras recolectadas en cinco provincias de Costa Rica para analizar la presencia de especies de

Preparación de muestras y detección ELISA. Para la detección de INSV, IYSV, TSWV y el serogrupo GRSV/TCSV, utilizamos reactivos comerciales de ELISA de Agdia, Elkhart, IN, siguiendo las instrucciones del fabricante. El proceso comenzó triturando aproximadamente 0.5 gramos de tejido vegetal en 1 mL de un tampón de extracción general. La composición de este tampón incluyó 136 mM de NaCl, 8 mM de Na2HPO4, 1.5 mM de KH2PO4, 2.7 mM de KCl, 10 mM de Na2SO3, 2 % (v/v) de Tween-20, 2 % (w/v) de Polivinilpirrolidona MW 40,000, 0.2 % (w/v)

de albúmina de huevo de gallina y se ajustó el pH a 7.4. Cada muestra se preparó en tres réplicas y se almacenó a -35 °C hasta su uso en las pruebas de ELISA. Para el procedimiento de ELISA, las muestras se probaron en pozos duplicados. Cada placa incluía dos pozos de controles positivos comerciales certificados (Agdia) y cuatro pozos de controles negativos. La absorbancia se midió a 405 nm después de una hora y se extendió a dos horas específicamente para IYSV, utilizando un lector de microplacas Multiskan FC (Thermo Scientific, China). Una muestra se consideró positiva si su valor promedio de absorbancia era mayor que el doble del promedio de los pozos de control negativo correspondientes, según el criterio establecido por Sutula et al. (1986). En casos de resultados dudosos, las muestras se volvieron a analizar siguiendo el mismo protocolo, pero utilizando un tampón de conjugado enzimático (tampón ECI, protocolo de Agdia) tanto con cómo sin la adición de un 5 % de leche en polvo descremada. Este paso se incluyó para mitigar los falsos positivos, un método respaldado por Smith et al. (2006).

Análisis longitudinal de la detección de INSV y TSWV en Costa Rica. Los informes del laboratorio de diagnóstico para la detección de INSV y TSWV en Costa Rica, realizados en el Laboratorio de Patógenos Vegetales Obligatorios y sus Vectores (LaFOV), Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, disponibles desde el año 2000, constituyen nuestra principal fuente de datos. Este período de 23.5 años de registros (de 2000 a julio de 2023) proporciona la visión más completa que tenemos sobre la frecuencia de detección de INSV y TSWV en el país. Las muestras enviadas al laboratorio de diagnóstico se dividen en dos categorías: (i) material vegetal asintomático destinado a la exportación, que requiere certificación fitosanitaria y probablemente está libre de virus, y (ii) material vegetal sintomático, generalmente enviado por agricultores y agentes de extensión, que probablemente esté infectado por virus, aunque no exclusivamente por orthotospovirus. Estos registros, que abarcan muestras tanto asintomáticas como sintomáticas de diversas dimensiones de fincas e invernaderos, ofrecen una estimación valiosa de la frecuencia relativa de la ocurrencia de virus en Costa Rica a lo largo de los años.

Refinamiento de la detección del virus de la mancha necrótica de Impatiens mediante RT-PCR: Para mejorar la precisión de la identificación de INSV, llevamos a cabo un análisis específico mediante RT-PCR en 20 muestras que resultaron positivas para INSV mediante ELISA. Este análisis detallado incluyó el uso de cebadores tanto de ortotospovirus de amplio espectro como de cebadores específicos diseñados para INSV, según se detalla en Cuadro 2 y Figura 1. El ARN se extrajo de cada muestra utilizando el RNeasy Plant Minikit (Qiagen, Alemania). Posteriormente, cuantificamos el ARN total utilizando un espectrofotómetro Na-

Cebadores Secuencia 5’ a 3’ Tamaño de amplicón (bp) Perfil térmico Referencia
Detección de Orthotospovirus (Varias especies)
BR60 BR65 CCCGGATCCTGCAGAGCAAATGTGTCA ATCAAGCCTTCTGAAAGTCAT 453 95 °C x 1 min; 30 x (94 °C x 30 s, 48 °C x 1 min, 72 °C); 72 °C x 7 min Eiras et al.,2001
BR035 PDH006 GAATATATGACACCATTG CCCAGAGCAATCAGTGCA 514 95 °C x 1 min; 30 x (94 °C x 30 s, 48 °C x 1 min, 72 °C); 72 °C x 7 min Eiras et al., 2001
NS1 CLA1 CCCTGCAGGATCCAGAGCAATCAGTGCA GCAGGCTTCAATGAATGC 865 95 °C x 1 min; 30 x (94 °C x 30 s, 48 °C x 1 min, 72 °C x 1 min); 72 °C x 7 min Eiras et al., 2001
gM410 gM870c AACTGGAAAAATGATTYNYTTGTTGG ATTAGYTTGCAKGCTTCAATNAARGC 500 95 °C x 1 min; 35 x (94 °C x 30 s, 52 °C x 30 s, 72 °C x 30 s); 72 °C x 10 min Chen et al., 2012
gL2740 gL3920c ATGGGDATNTTTGATTTCATGRTATGC TCATGCTCATSAGRTAAATYTCTCT 1200 95 °C x 2 min; 30 x (94 °C x 30 s, 50 °C x 30 s, 72 °C x 2 min); 72 °C x 5 min Chen et al., 2012
gL3637 gL4435c CCTTTAACAGTDGAAACAT CATDGCRCAAGARTGRTARACAGA 810 95 °C x 2 min; 30 x (94 °C x 30 s, 50 °C x 30 s, 72 °C x 2 min); 72 °C x 5 min Chu et al., 2001
gL3637 gL4510c CCTTTAACAGTDGAAACAT TCATCRGARTGBACMATCCATCT 890 95 °C x 2 min; 30 x (94 °C x 30 s, 50 °C x 30 s, 72 °C x 2 min); 72 °C x 5 min Chu et al., 2001
Detección específica de INSV
INSV-589 TOS-R15 CCCAAGACACAGGATTTCA GGGAGAGCAATYGWGKYR 589 95 °C x 2 min; 35 x (94 °C x 30 s, 54 °C x 30 s, 72 °C x 1 min); 72 °C x 5 min Uga & Tsuda, 2005
Subunidad 18S del ARN ribosómico de las plantas
18S-F 18S-R TCTGCCCGTTGCTCTGATGAT CCTTGGATGTGGTAGCCGTTT 193 95 °C x 1 min; 40 x (94 °C x 30 s, 55 °C x 30 s, 72 °C x 35 s); 72 °C x 5 min Zhu et al., 2012
Cuadro 2: Pares de cebadores y perfiles térmicos usados para la detección de orthotospovirus.

noDrop 2000C UV-Vis (ThermoScientific, EE. UU.) para garantizar una concentración adecuada para los pasos siguientes. Luego, preparamos el cADN de hebra simple a partir de 5 µL del ARN extraído para cada muestra, logrando un volumen final de reacción de 20 µL. Esta síntesis se realizó utilizando el kit RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis o el kit Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific, Lituania), utilizando hexámeros aleatorios. El cADN sintetizado se almacenó a -35 °C para su conservación. Para asegurar la integridad del cADN y verificar posibles inhibidores de la amplificación o degradación del ARN, utilizamos cebadores que apuntaban a un fragmento de 193 pb de la subunidad ribosomal ARN 18S de plantas, que sirve como gen de referencia para estudios

Figura del artículo
Figura 1: Representación de las posiciones de anillamiento de los pares de cebadores en referencia al genoma completo de ; números de accesión entre paréntesis para cada segmento del genoma. Traslape entre cebadores y secuencias finales parciales obtenidas en esta investigación (rectángulos grises) con el tamaño esperado (pb). Los valores de pares de bases debajo de cada cebador representan las posiciones del primer y último nucleótido en el genoma de referencia del amplicon correspondiente.

de expresión génica en plantas (citado de Zhu et al., 2012). Las mezclas de PCR, con un total de 25 µL cada una, incluyeron 2 µL del cADN sintetizado, 12.5 µL de DreamTaq PCR Master Mix 2X (Thermo Scientific) y 200 nM de cada cebador. Las condiciones exactas de termociclado para cada par de cebadores se ajustaron según las especificaciones indicadas en el Cuadro 2, utilizando termocicladores avanzados como PTC-200 (MJ Research, Canadá), MJ Mini (BioRad, Singapur) y Corbett Research CG1-96 (Corbett Life Science, Australia). Después de la PCR, los productos se visualizaron en un transiluminador de luz UV (55W, BXT-26M, Uvitec, Francia). Esto se hizo después de la electroforesis en un gel de agarosa al 1 % con tampón TAE 1X, y el gel se tiñó con GelRed 10000X (Biotium Inc., EE.UU.) incorporado en el tampón de carga (6X Thermo Scientific) para una visualización óptima. Para capturar una instantánea genética completa, se emplearon varios pares de cebadores para secuenciar diferentes segmentos del genoma de orthotospovirus: pequeño (S), mediano (M) y grande (L). Este enfoque, que a veces implicaba amplicones superpuestos (como se muestra en la Figura 1), nos permitió obtener secuencias parciales de cuatro ORFs distintos de orthotospovirus (ilustrados en la Figura 1): el segmento S(N), el segmento M(NSM), el segmento M(G) y el segmento L(L). Estas secuencias abarcan regiones críticas como la nucleocápside, la proteína de movimiento, el precursor de la glicoproteína y la ARN polimerasa dependiente del ARN, ofreciendo una comprensión más profunda de la estructura genética del virus.

Análisis del virus de la mancha necrótica de Impatiens: secuenciación y construcción de redes de haplotipos

Análisis del virus de la mancha necrótica de Impatiens: secuenciación y construcción de redes de haplotipos

Proceso de secuenciación. Se realizó la secuenciación directa de todos los amplicones derivados del subconjunto seleccionado de 20 muestras, previamente identificadas como positivas para INSV mediante ELISA. Esta secuenciación, realizada en direcciones tanto hacia adelante como hacia atrás, empleó los mismos pares de cebadores utilizados en las amplificaciones por PCR. Macrogen Inc. (Corea) fue responsable de la purificación y secuenciación de estos productos de PCR. Las secuencias resultantes se ensamblaron cuidadosamente y se editaron meticulosamente utilizando el software BioEdit (versión 7.2.5). Las secuencias obtenidas se archivaron en la base de datos GenBank, un repositorio mantenido por el Instituto Nacional de Salud. Nuestra estrategia para analizar las relaciones filogenéticas de INSV implicó la obtención de secuencias representativas de diversas ubicaciones geográficas y plantas hospederas de GenBank. Empleamos una estrategia de búsqueda específica centrada en “Impatiens necrotic spot”, categorizando las secuencias por sus respectivos segmentos genómicos: S, M y L. Se construyeron árboles filogenéticos iniciales para cada una de las regiones genómicas amplificadas: S(N), M(NSM), M(G) y L(L). Esta fase incluyó la incorporación de secuencias relevantes disponibles en GenBank. Los modelos de sustitución de ADN se seleccionaron meticulosamente para ajustarse a nuestros análisis filogenéticos, que ejecutamos utilizando el software MEGA X (Kumar et al., 2018). Sin embargo, las construcciones filogenéticas iniciales no revelaron patrones de agrupación definitivos ni robustos. En nuestra búsqueda de una comprensión más detallada de la diversidad de INSV a escala global, alineamos las secuencias S(N) de nuestro estudio con 81 secuencias de INSV recuperadas de GenBank, centrándonos en un segmento de 261 pb del ORF N. Esta alineación se llevó a cabo utilizando el algoritmo MUSCLE y se perfeccionó recortando los sobresalientes de las secuencias para garantizar uniformidad. Con el software DnaSP6 (Rozas et al., 2017), realizamos una determinación exhaustiva de haplotipos y un análisis de población en este conjunto de datos, que abarcó 79 aislados (excluyendo dos debido a datos geográficos faltantes). Las secuencias se categorizaron cuidadosamente por países o regiones para un análisis detallado. Para visualizar las relaciones genéticas y variaciones entre estos aislados de INSV, construimos una red de haplotipos. Esto se logró utilizando el software PopART (Análisis Poblacional con Árboles Reticulados, http://popart. otago.ac.nz), aplicando el método de inferencia de red TCS (Clement et al., 2000) para mapear las conexiones intrincadas entre los diversos haplotipos. En un análisis posterior más detallado, alineamos y concatenamos diferentes regiones del genoma de INSV que se amplificaron y secuenciaron con éxito en la misma muestra. Este análisis incluyó doce muestras de Costa Rica (donde se obtuvieron datos de secuencia para las cuatro regiones objetivo) y cinco muestras internacionales de INSV con genomas completos disponibles. La alineación integral, que abarcaba 2,945 posiciones, se sometió a un análisis de Máxima Verosimilitud utilizando un modelo Tamura de 3 parámetros con variación de tasa distribuida gamma (+G), y este proceso involucró 2,000 permutaciones en el software MEGA X. Los análisis se llevaron a cabo para todos los segmentos genómicos, tanto como sin la inclusión del virus de la mancha anular del tomate (TSWV) como grupo externo, utilizando sus secuencias de referencia (S: NC_002051; M: NC_002050; y L: NC_002052) con fines comparativos.

Resultados

Resultados

Análisis ELISA y síntomas observados. Las pruebas de ELISA identificaron INSV e IYSV en las muestras, siendo INSV relativamente común en Costa Rica (58 de 295 muestras). Notablemente, no se detectaron TSWV y el serogrupo que comprende GRSV y TCSV. INSV se encontró en 12 de las 39 especies de plantas evaluadas, incluyendo pimiento (Capsicum annuum), cebolla (Allium cepa), tomate (Solanum lycopersicum) e iris (Iris sp.), que tuvo el mayor número de muestras positivas (Cuadro 3). Los síntomas comunes asociados con INSV incluyeron anillos y manchas cloróticas o necróticas, así como patrones de anillos cloróticos (Figura 2). IYSV se detectó exclusivamente en 10 muestras de hojas de cebolla.

Análisis longitudinal de la aparición de TSWV e INSV. Nuestra investigación sobre la presencia histórica del virus del marchitamiento moteado del jitomate (TSWV) y el virus de la mancha necrótica de la impatiens (INSV) en Costa Rica fue motivada por la ausencia de TSWV en nuestros estudios recientes de muestras y por el hecho de que las únicas ocurrencias documentadas de TSWV en el país se informaron en 1990 (Rivera et al., 1990) y 1991 (Hsu and Lawson, 1991). Para profundizar en este asunto, se revisó los datos de los registros de servicios de la clínica de diagnóstico desde el año 2000 hasta julio de 2023. Estos registros consistieron principalmente en plantas ornamentales destinadas a la exportación o importación, pero también incluyeron muestras hortícolas de cultivadores que abarcaban desde pequeña hasta gran escala. Se analizaron un total de 1,027 muestras para TSWV y 1,889 para INSV. De estas, 43 muestras (4.2%) resultaron positivas para TSWV, y 290 muestras (15.4%) para INSV, según se determinó mediante DAS-ELISA utilizando anticuerpos comerciales (Cuadro 3). Es destacable que entre 2008 y 2010, el número anual de muestras positivas para INSV superó las 50. En contraste, la cantidad de muestras positivas para TSWV se mantuvo por debajo de diez cada año. Después de 2015, la frecuencia de detección de ambos virus disminuyó significativamente. A lo largo de los 23.5 años abordados en el análisis, TSWV se detectó solo en 11 años, mientras que INSV se detectó en 17 años, como se muestra en la Figura 3. Esta tendencia destaca los cambios en los patrones de prevalencia viral y subraya la necesidad de una vigilancia continua.

Confirmación por RT-PCR de la aparición de INSV. Los análisis de RT-PCR confirmaron la presencia de INSV en nueve taxones de plantas diferentes: Antirrhinum majus, Capsicum annuum, Hippeastrum, Impatiens, Iris, Ocimum basilicum, Plectranthus scuttellarioides, Solanum lycopersicum y el híbrido artificial de orquídea Bakerara. Todas las especies de plantas que resultaron positivas para INSV mediante ELISA también arrojaron resultados positivos en pruebas de RT-PCR utilizando al menos dos pares de cebadores diferentes, seguidos de secuenciación (como se muestra en la Figura 1 y la Cuadro 4). Excepciones a esto incluyeron Browallia sp., Eustoma sp. y muestras de cebolla. Las plantas de Browallia y Eustoma, lamentablemente, se marchitaron y murieron en nuestro invernadero antes de que pudiéramos recolectar muestras de tejido para la extracción de ARN, impidiendo su prueba mediante RT-PCR. Además, las muestras de cebolla no fueron sometidas a pruebas de RT-PCR, ya que la presencia de IYSV en estas muestras ya

Figura del artículo
Figura 2: Síntomas diversos del virus del anillado necrótico de la impatiens (INSV) en múltiples huéspedes confirmados por ELISA, RT-PCR y secuenciación parcial. A: Anillos concéntricos necróticos en Impatiens ( sp.) T031. B, C: Anillos y manchas cloróticas en Boca de Dragón () T057. D: Estrías cloróticas y necróticas en hojas de orquídea T024. E, F: Mosaico clorótico en Amarilis ( sp.) T161 e Iris ( sp.) T184. G: Anillos concéntricos necróticos en Coleo () T157. H: Patrones cloróticos en Albahaca () T156. I, M: Patrones de anillos concéntricos cloróticos en hojas de Pimiento Dulce () T250 y T092. J, K, L: Maduración irregular, patrones de anillos y deformación en frutos de Pimiento Dulce T092, T107, T094. N, O: Patrones cloróticos, anillos y superficie irregular en frutos de Tomate () T263 y T303.

Hospedante (Nombre común) No. de muestras No de muestras positivasy
INSV IYSV TSWV GRSV/ TCSV
Amaryllidaceae
Allium cepa (cebolla) 38 6 10 0 0
Allium sativum (ajo) 2 0 0 0 0
Hippeastrum sp.(“amarilis”) 1 1 0 0 0
Tulbaghia violaceae (ajillo) 1 0 0 0 0
Anacardiaceae
Spondias purpurea (jocote) 1 0 0 0 0
Apocynaceae
Mandevilla sp. (dipladenia) 1 0 0 0 0
Trachelospermum jasminoides (jazmin estrella) 1 0 0 0 0
Cataranthus roseus (vinca) 4 0 0 0 0
Asparagaceae
Ornithogalum sp. (estrella de Belén) 1 0 0 0 0
Asteraceae
Lactuca sativa (lechuga) 6 0 0 0 0
Balsaminaceae
Impatiens sp. (impatiens) 7 3 0 0 0
Caricaceae
Carica papaya (papaya) 5 0 0 0 0
Cucurbitaceae
Citrullus lanatus (sandía) 2 0 0 0 0
Cucumis melo (melón) 13 0 0 0 0
Cucumis sativus (pepino) 1 0 0 0 0
Cucurbita pepo (calabaza, zucchini) 2 0 0 0 0
Sechium edule (chayote) 1 0 0 0 0
Sechium tacaco (tacaco) 1 0 0 0 0
Fabaceae
Arachis pintoi (frijol pinto) 3 0 0 0 0
Phaseolus vulgaris (frijol) 4 0 0 0 0
Gentianaceae
Eustoma sp. (lisianthus) 3 3 0 0 0
Iridaceae
Iris sp. (iris) 4 4 0 0 0
Lamiaceae
Ocimum basilicum (albahaca) 1 1 0 0 0
Plectranthus scuttellarioides (coleo) 2 2 0 0 0
Liliaceae
Lilium sp. (lirios) 2 0 0 0 0
Malvaceae
Gossypium hirsutum (algodón) 1 0 0 0 0
Hibiscus sp. (hibiscus) 4 0 0 0 0
Orchidaceae
Several species and hybridsz (orquidea) 45 1 0 0 0
Oxalidaceae
Oxalis sp. 2 0 0 0 0
Plantaginaceae
Antirrhinum majus (boca de dragón) 2 2 0 0 0
Rosaceae
Fragaria x ananassa (fresa) 2 0 0 0 0
Solanaceae
Browallia sp. (violeta de arbusto) 2 1 0 0 0
Calibrachoa sp. (calibracoa) 4 0 0 0 0
Capsicum annuum (pimiento, chile dulce) 68 30 0 0 0
Petunia sp. (petunia) 14 0 0 0 0
Solanum lycopersicum (jitomate) 37 4 0 0 0
Solanum melongena (berenjena) 1 0 0 0 0
Solanum quitoense (naranjilla, lulo) 1 0 0 0 0
Solanum tuberosum (papa) 4 0 0 0 0
Zingiberaceae
Hedychium sp. 1 0 0 0 0
Total 295 58 10 0 0
Cuadro 3: Número total de muestras positivas por especie vegetal evaluadas por la técnica de ELISA para detectar tres orthotospovirus en Costa Rica.

se había confirmado en un estudio anterior (Montero-Astúa et al., 2017). En total, obtuvimos y editamos con éxito 72 secuencias parciales finales o contigs. Estas incluyeron 18 secuencias cada una para los genes de la nucleocápside y la proteína de movimiento, 20 para el gen del precursor de la glicoproteína y 16 para el gen de la ARN polimerasa dependiente de ARN viral (RdRp). Todas estas secuencias se han enviado a GenBank y se documentan en la Cuadro 4.

Análisis de red de haplotipos. En el análisis filogenético inicial de las secuencias de S(N), M(NSM), M(G) y L(L) de INSV, incluyendo secuencias de otros países, observamos la falta de conglomerados bien definidos (datos no mostrados). En consecuencia, dirigimos nuestra atención a un análisis de haplotipos del conjunto de datos de secuencias de S(N). Este conjunto de datos comprendía un segmento de 261 pb del ORF de la nucleocápside de los aislamientos de INSV disponibles globalmente en GenBank, junto con las 18 secuencias que obtuvimos en este estudio (Figura 4). En nuestro análisis de red de haplotipos, identificamos cuatro haplotipos distintos de la secuencia parcial del ORF de la nucleocápside en Costa Rica.

Figura del artículo
Figura 3: Detección a largo plazo de los virus del anillado necrótico del Impatiens y del marchitamiento manchado del jitomate por ELISA. Este gráfico muestra la frecuencia de detección tanto del Virus del anillado necrótico de la Impatiens como del Virus del marchitamiento manchado del jitomate a lo largo de un período de 23.5 años (2000 a julio de 2023). Los datos, obtenidos de muestras enviadas a los servicios de diagnóstico del Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular, Universidad de Costa Rica, ilustran las tendencias temporales y los patrones de ocurrencia de estos virus en Costa Rica.

Entre ellos, un haplotipo destacó como predominante en el país, y curiosamente, también se encuentra en China, Japón, Europa y Corea. Los otros dos haplotipos, aunque menos prevalentes en Costa Rica, están más estrechamente relacionados con un haplotipo principal observado en Europa, Japón, Nueva Zelanda y Estados Unidos. Además, realizamos un análisis concatenado de cuatro regiones del ge-

Hospedante ID Sitiow, provincia Secuenciax identificacióny
S(N) M(NSM) M(G) L(L)
Antirrhinum majus T057 D, Cartago MH687991 MH673625 MH673643 MH487473
Capsicum annuum T092 N, Alajuela MH687992 MH673626 MH673644 MH487474
T093 M, Alajuela MH687993 MH673627 MH673645 MH487475
T094 M, Alajuela MH687994 MH673628 MH673646 MH487476
T096 M, Alajuela MH687995 MH673629 MH673647 MH487477
T107 N, Alajuela MH687996 MH673630 MH673648 MH487479
T109 N, Alajuela MH687997 MH673631 MH673649 MH487480
T245 II, Cartago MH688003 MH673638 MH673657 MH487487
T250 II, Cartago MH688004 MH673639 MH673658 MH487488
T251 II, Cartago MH688005 MH673640 MH673659 MH487489
Hippeastrum sp. T161 D, Cartago MH688001 MH673635 MH673653 MH487483
Impatiens sp. T031 C, Alajuela MH687990 MH673624 MH673642 MH487472
Iris sp. T184 CC, Cartago ---z MH673636 MH673654 MH487484
T186 CC, Cartago --z MH673637 MH673655 MH487486
Ocimun basilicum T156 D, Cartago MH687998 MH673632 MH673650 --z
Orchid T024 B, Alajuela MH687989 MH673623 MH673641 --z
Plectranthus scuttellarioides T157 D, Cartago MH687999 MH673633 MH673651 MH487481
T158 D, Cartago MH688000 MH673634 MH673652 MH487482
Solanum lycopersicum T263 O, San José MH688006 --z MH673660 --z
T303 O, San José MH688007 --z MH673661 --z
Total (n) 20 8, 3 18 18 20 16
Cuadro 4: Secuencias parciales nucleotídicas e identidad viral determinada para un subgrupo de muestras positivas por ELISA para INSV.

noma (segmentos del genoma S, M y L) que amplificamos y secuenciamos. Este análisis incluyó 12 muestras de Costa Rica y cinco genomas de INSV disponibles en GenBank (ilustrados en la Figura 5). Los resultados mostraron que las muestras de INSV de Costa Rica se agruparon juntas, claramente separadas de las secuencias de referencia. Es importante señalar que las estructuras de subgrupos de las muestras de Costa Rica se alinearon generalmente con sus lugares geográficos de origen. Este hallazgo indicó una mayor diversidad dentro de la población de INSV en Costa Rica en comparación con lo sugerido por la red de haplotipos. En el árbol

Figura del artículo
Figura 4: Gráfico de la Red de Haplotipos del Virus del anillado necrótico de la impatiens. Este gráfico representa una red de haplotipos inferida mediante el método TCS, basada en un alineamiento de secuencias de 261 bp del ORF de la proteína nucleocápside (segmento S[N]) del Virus del anillado necrótico de la impatiens. La red incluye datos de 81 aislados, representando visualmente las relaciones genéticas y la diversidad entre los diferentes haplotipos del virus.

filogenético, las ramas y nodos delimitaron claramente las diferencias entre los 12 aislamientos costarricenses incluidos en nuestro estudio (Figura 5). Esta variación en la diversidad genética destaca la naturaleza compleja de la propagación y evolución de INSV en diferentes regiones geográficas.

Figura del artículo
Figura 5: Análisis filogenético integral de aislados del virus del anillado necrótico de la impatiens. Esta figura muestra un árbol filogenético construido a partir de un alineamiento de secuencias concatenadas (2945 posiciones) que incluyen regiones del nucleocápside [S(N)], precursor de la glicoproteína [M(G)], proteína de movimiento [M(NSM)] y ORFs de la polimerasa viral [L(L)]. El árbol incluye aislados de varios países, identificados por códigos de tres letras según ISO 3166-1: CHN (China), ITA (Italia), KOR (Corea del Sur) y USA (Estados Unidos de América). Para los aislados de Costa Rica, códigos de letras adicionales y distintos entre paréntesis indican ubicaciones geográficas independientes. El análisis, realizado en MEGA X, utilizó el método de Máxima Verosimilitud con un modelo de parámetro Tamura-3 y una tasa de variación en nucleótidos distribuida gamma (+G), con 2000 permutaciones. La barra de escala indica el número de sustituciones de nucleótidos por sitio.

Discusión

Discusión

En este estudio, se centró en la presencia histórica de TSWV e INSV en Costa Rica, motivados por la ausencia de TSWV en las muestras recientes y solo informes esporádicos de TSWV que datan de 1990 y 1991. Nuestro análisis de los registros de los servicios de la clínica de diagnóstico, que abarcan el período desde 2000 hasta julio de 2023, reveló una baja ocurrencia de TSWV, con períodos alternantes sin detección. Este patrón se alinea con las tendencias globales que sugieren fluctuaciones cíclicas en las ocurrencias de TSWV, según indican Tentchev et al. (2011) y discuten más a fondo Kaye et al. (2011) en relación con la dinámica poblacional de TSWV en los cultivos de cacahuete en Carolina del Norte y Virginia. Estas dinámicas pueden estar influenciadas por varios factores, incluida la biología del vector, las preferencias de alimentación de los trips y las medidas de control dirigidas específicamente contra TSWV implementadas previamente en Costa Rica. Los cambios recientes en las poblaciones de vectores y la competencia entre especies de moscas blancas, como se señala en estudios de Can-Vargas et al. (2020) y ValverdeMéndez et al. (2023), también podrían contribuir a estas tendencias observadas.

Cabe destacar que en este estudio no detectó el serogrupo de orthotospovirus GRSV/TCSV, sugiriendo su ausencia en la región continental del Caribe en América Central. Esto a pesar de su prevalencia en las islas del Caribe. El uso de cebadores degenerados de orthotospovirus en este estudio, no identificaron virus distintos a INSV, indicando una posible falta de diversidad entre los orthotospovirus en Costa Rica. La encuesta realizada entre 2013 y 2014, subraya la necesidad de una vigilancia continua para monitorear posibles introducciones de nuevas especies de orthotospovirus.

Estos hallazgos establecen a INSV como un orthotospovirus prevalente en Costa Rica, en contraste con su aparente ausencia en otros países de América Central. Esta discrepancia probablemente refleje una brecha en la investigación regional de orthotospovirus en lugar de una ausencia real del virus. Estudios previos han identificado dos clados distintos de aislamientos de INSV, los clados del Hemisferio Occidental y Asiático. Nuestro análisis de la red de haplotipos, basado en una secuencia parcial del nucleocápside, sugiere la presencia de dos haplotipos principales y varios nodos secundarios, con la mayoría de las secuencias costarricenses alineadas con el clado asiático propuesto. Esta observación indica al menos dos introducciones separadas de INSV en Costa Rica. Además, nuestros resultados sugieren un agrupamiento geográfico de los aislamientos de INSV dentro de Costa Rica, con evidencia de diferenciación genética basada en el lugar de origen. Esto está en línea con hallazgos de estudios anteriores, que también indicaron una tendencia de los aislamientos de INSV a agruparse geográficamente y reportaron una diversidad genética limitada dentro de las poblaciones locales de INSV.

Este estudio subraya la necesidad de más investigaciones para evaluar con precisión la diversidad genética de la población de INSV en Costa Rica. Tales esfuerzos son cruciales para comprender la epidemiología de los orthotospovirus en la región y para desarrollar estrategias efectivas de manejo.

Conclusiones

Conclusiones

La encuesta exhaustiva realizada en 2013 y 2014 en toda Costa Rica ha proporcionado ideas significativas sobre la prevalencia y diversidad de orthotospovirus en la región. El virus de la mancha necrótica del impatiens (INSV) se detectó en un número considerable de muestras (58 de 295) analizadas mediante ELISA. El virus exhibió un amplio rango de hospederos, afectando a 13 taxones diferentes, incluyendo Allium cepa, Capsicum annuum y Solanum lycopersicum, entre otros. Por otro lado, el virus de la mancha amarilla del iris (IYSV) solo se identificó en diez muestras de cebolla. Cabe destacar que en este estudio no se detectaron el virus del bronceado del tomate (TSWV), el virus de la mancha anular del cacahuate (GRSV) y el virus de la mancha clorótica del tomate (TCSV). Sin embargo, los datos históricos confirman la presencia de TSWV en Costa Rica, con una disminución notada en las solicitudes de detección y las ocurrencias a lo largo del tiempo.

El análisis basado en un fragmento de la secuencia del nucleocápside indicó una baja diversidad de INSV en Costa Rica, con solo cuatro haplotipos identificados entre las 20 muestras analizadas. Un análisis más profundo, que incluyó regiones concatenadas de los segmentos del genoma S, M y L, sugirió una variabilidad relativamente mayor de INSV dentro del país. Esta discrepancia subraya la necesidad de un muestreo y análisis adicionales para determinar con precisión la diversidad genética de INSV en Costa Rica.

Estos datos sugieren la presencia de dos linajes de INSV en Costa Rica: los linajes asiáticos y del Hemisferio Occidental. Esta hipótesis concuerda con los patrones de distribución global de INSV e indica la ocurrencia de múltiples eventos de introducción en la región. Dada la naturaleza dinámica del comercio internacional y el movimiento humano, se hace esencial llevar a cabo una encuesta actualizada y más extensa en todo el país para comprender la situación actual de los orthotospovirus en Costa Rica. Además, existe una necesidad crítica de llevar a cabo investigaciones integrales en toda América Central. Estas investigaciones deben centrarse en descripciones de síntomas, listas de hospederos susceptibles e identificación de poblaciones de trips involucrados en la transmisión del virus, con el fin de comprender la epidemiología de los orthotospovirus en la región. Obtener datos de secuencias será crucial para comprender las estructuras de población e identificar cepas potencialmente de alto riesgo, como aquellas capaces de superar la resistencia. Esta información es vital para desarrollar estrategias que controlen la introducción y propagación de cepas y especies virales específicas en la región. Estrategias efectivas de gestión, que incluyan inspecciones aduaneras, medidas de cuarentena y colaboración regional, son imperativas para mitigar el impacto de estos virus en la agricultura en América Central.

En conclusión, nuestro estudio destaca la importancia del monitoreo continuo, la investigación y la cooperación regional en la gestión de los orthotospovirus, un paso crucial hacia la sostenibilidad y productividad agrícola en América Central.