Identificación de fitoplasmas asociados al Bunchy Top de la papaya en Colima, México

Introducción

México es el tercer productor de papaya (Carica papaya) en el mundo y principal proveedor de fruta fresca a Estados Unidos de América y Canadá, donde las ventas anuales superan las 350 000 toneladas, con un valor de 335 millones de dólares (SIAP, 2020). En este país la producción de la caricácea está localizada en las regiones Sur-Sureste y Centro Occidente, siendo Oaxaca, Colima y Chiapas los principales estados productores (SIAP, 2020). El estado de Colima, ubicado en la región Occidente por la costa sur del Océano Pacífico, posee un registro de producción de 192 417 toneladas y es el principal exportador nacional (Consejo de Productores de Papaya del estado de Colima [COEPAPAYA A.C.], 2017; SIAP, 2020). En 2019, en 64 agroecosistemas de papaya visitados en cuatro municipios del estado de Colima, se observaron plantas con acortamiento de entrenudos que originaban el arrepollamiento de las hojas apicales. Estas plantas también presentaron hojas con clorosis, amarillamiento, deformación y/o necrosis marginal. Estos síntomas son típicos de la enfermedad Bunchy Top (BT) (Cook, 1931; Story y Halliwell, 1969), y semejantes a los descritos en Cuba como síndromes “papaya bunchy top” (PBT) y “bunchy top symptom” (BTS) (Acosta et al., 2013).

El BT es inducido por fitoplasmas, rickettsias y virus, a veces en infecciones mezcladas (fitoplasmas + rickettsias o fitoplasmas + virus), y se ha reportado en República Dominicana, Cuba, Haití, Jamaica, Puerto Rico, Costa Rica, Perú (Martorell y Adsuar, 1952; Story y Halliwell, 1969; Davis et al., 1998; Arocha et al., 2003; Acosta et al., 2013; Luis-Pantoja et al., 2015; Wei et al., 2017) y más recientemente en Nigeria (Kazeem et al., 2021).

Considerando que en México se han detectado fitoplasmas en plantas de papaya con síntomas parecidos al BT (Pogoshyan et al., 2004; Navarrete-Yabur et al., 2005; Rojas-Martínez et al., 2011), y que en Colima, esta enfermedad ha adquirido mayor importancia económica y su estudio se ha abordado escasamente (productores de papaya del estado de Colima, comunicación personal); se han planteado los siguientes objetivos: a) determinar la presencia de fitoplasmas en plantas de papaya con síntomas de BT, así como en malezas e insectos asociados al cultivo, y b) establecer la identidad a nivel grupo y/o subgrupo 16Sr.

En noviembre y diciembre de 2019, se recolectaron 256 muestras de papaya en 64 agroecosistemas comerciales localizados en los municipios de Tecomán, Colima, Ixtlahuacán y Armería. Del total de muestras, 64 fueron asintomáticas y 192 presentaron síntomas relacionados con BT. De cada planta se obtuvo una muestra compuesta constituida por tres hojas (lámina y pecíolo), cada una de las cuales se recolectó de los estratos superior, medio e inferior de la planta. De cada planta de papaya (sintomática o asintomática muestreada) se recolectaron (de acuerdo con su disponibilidad y mayor abundancia) hasta cinco especies de malezas presentes en un diámetro de 2 m. Asimismo, se colectaron insectos con una red entomológica de golpeo con tres barridos, de arriba y abajo, sobre la planta de papaya y malezas adyacentes. Los insectos se conservaron en etanol al 96 % para su posterior clasificación en morfoespecies. Las malezas e insectos que fueron positivos para fitoplasmas se identificaron a nivel especie.

A partir de nervaduras centrales y de pecíolos de hojas de papaya y malezas, así como ejemplares completos de insectos (uno a cinco, según tamaño y disponibilidad), se extrajo el ADN total con un protocolo de enriquecimiento con ADN de fitoplasma basado en CTAB (Ahrens y Seemuller, 1992) y con ayuda de un homogeneizador (Tissue Lyser, Qiagen, Alemania) (Stillson y Szendrei, 2020). El ADN se evaluó por espectrofotometría de luz UV (NadoDrop 2000, Fisher Scientific, EUA) y por amplificación por PCR del gen de la proteína ribosomal S16 (rps16) de plantas (Oxelman et al., 1997) o citocromo oxidasa subunidad I (COI) de insectos (Folmer et al., 1994), como controles internos en volúmenes de reacción de 25 μL con 50 ng de ADN.

La detección de fitoplasmas se realizó en 200 ng de ADN por PCR punto final anidada de los genes 16Sr (primera ronda: iniciadores P1/P7 y anidada: iniciadores R16F2n/R16R2 y R16mF2/R16mR1) (Deng y Hiruki, 1991; Schneider et al., 1995; Gundersen y Lee, 1996; Lee et al., 1993) y secA (primera ronda: iniciadores secAFor1/secARev3 y anidada: iniciadores SecAFor5/SecARev2) (Dickinson y Hodgetts, 2013).

La identificación se hizo por secuenciación, PCR-RFLPs in vitro e in silico del gen 16Sr y análisis filogenéticos de secA y 16Sr. Para la secuenciación, los amplicones de la PCR anidada para 16Sr (iniciadores R16mF2/R16mR1) y secA de las muestras positivas se purificaron con el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA) y se secuenciaron en ambos sentidos con los iniciadores R16mF2/R16mR1 y SecAFor5/SecARev2, con el método de dideoxi o cadena terminal en Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias resultantes se analizaron con el programa MEGAX (Kumar et al., 2018) y la función BLASTn del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi), para su depósito en el GenBank (https://submit.ncbi.nlm.nih. gov/).

Para las PCR-RFLPs in vitro, aproximadamente 1 μg de cada producto purificado de la PCR anidada para el gen 16Sr (iniciadores R16F2n/R16R2) de las muestras positivas, cuantificado por espectrofotometría de luz UV (NanoDrop 2000, Fisher Scientific, EUA) se digirió, por separado, con 10 U de las enzimas de restricción Taq I, Hae III, Sau 3AI, Kpn I, Tru I1 (Mse I), Alu I y Rsa I (Thermo Scientific, EUA), siguiendo las instrucciones del fabricante, para confirmar que el fragmento amplificado correspondiera a ADN de fitoplasmas (Lee et al., 1998). Los productos se separaron por electroforesis en geles de agarosa 3 % (p/v) en amortiguador TAE 1× y se tiñeron con bromuro de etidio (Sambrook y Russell, 2001).

Para los RFLPs in silico, las secuencias de los amplicones de la PCR anidada (iniciadores R16mF2/R16mR1), editadas manualmente con MEGAX (Kumar et al., 2018), se analizaron con el software iPhyClassifier (https://acortar.link/AikrtQ) para la asignación y/o confirmación de especies, grupos y subgrupos 16Sr.

Los análisis filogenéticos se hicieron independientemente con los genes secA y 16Sr. Para ello, secuencias de cada uno de los genes analizados de diferentes grupos de fitoplasmas reportados a nivel mundial (49 para secA y 51 para 16Sr) y de Bacillus subtilis (GenBank: X62035 para secA) o de Acholeplasma laidlawii (GenBank: U14905 para 16Sr) como grupos externos, se descargaron del GenBank y se alinearon con Clustal W. La construcción de las filogenias se realizó con el método de neighbor-joining con 1000 repeticiones de bootstrap. Todos los análisis se hicieron en MEGA X (Kumar et al., 2018).

Los fitoplasmas se detectaron en el 2.08 % (4 de 192) de plantas de papaya con síntomas asociados al BT (Cuadro 1). No se detectaron fitoplasmas en plantas asintomáticas. Las plantas positivas se recolectaron en los municipios de Colima e Ixtlahuacán (Cuadro 1) y presentaron tallos con acortamientos de entrenudos y hojas amarillas y cloróticas (Figura 1A). Las muestras positivas se confirmaron

por secuenciación de los genes secA (GenBank: ON303285-ON303288) y 16Sr (GenBank: PP348058-PP348061). Los análisis de secuencias de los genes secA y 16Sr con BLASTn, indican que, en dos de las cuatro muestras positivas, los fitoplasmas pertenecen al grupo 16SrI (GenBank secA: ON303286 y ON303287; 16Sr: PP348059 y PP348060), mientras que las dos restantes a los grupos 16SrX (GenBank secA: ON303288; 16Sr: PP348061) y 16SrXIII (GenBank secA: ON303285;16S: PP348058), respectivamente.

El perfil de los RFLPs in vitro del gen 16Sr (Figura 1B) mostró concordancia con los perfiles reportados por Lee et al. (1998) y con los obtenidos con iPhyClassifer (Figura 2), para las enzimas de restricción usadas, lo cual permitió autenticar el

ADN de los fitoplasmas detectados en este estudio. El análisis RFLPs in silico del gen 16Sr confirmó la presencia de las especies ‘Candidatus Phytoplasma asteris’ [grupo 16SrI (porcentajes de identidad: 99.44 y 99.60) y subgrupo 16SrI-AF (coeficiente se similitud: 1.00)], ‘Ca. Phytoplasma rhamni’ [grupo 16SrX (porcentaje de identidad: 93.31), subgrupo indeterminado] y ‘Ca. Phytoplasma hispanicum’ [grupo 16SrXIII (porcentaje de identidad: 99.37), subgrupo 16SrXIII-D (coeficiente se similitud: 0.95)] (Cuadro 2). Con respecto a los porcentajes de identidad y coeficiente de similitud obtenidos para los fitoplasmas de los grupos 16SrX y 16SrXIII, deberá analizarse con otros estudios, si se trata de nuevos (sub)grupos.

La identificación de los grupos de fitoplasmas aquí obtenidos también se corroboró por inferencias filogenéticas de los genes secA y 16Sr, puesto que en las filogenias obtenidas para ambos genes de los fitoplasmas detectados en este estudio, se agruparon con secuencias correspondientes a los mismos grupos 16Sr de fitoplasmas previamente identificados en México (GenBank 16S: MN807429) o en otros países (Figura 3).

Para nuestro conocimiento, este estudio documenta por primera vez la presencia de fitoplasmas 16SrI-AF, 16SrX y 16SrXIII en plantas de papaya con BT en México y Colima. Además, a nivel mundial, es la primera vez que se reporta la presencia del grupo 16SrX en papaya. En México, la primera detección de fitoplasmas en papaya se hizo por microscopía electrónica de barrido en Baja California Sur (Poghosyan et al., 2004). Posteriormente, mediante biología molecular, en Yucatán,

Campeche, Quintana Roo (Navarrete-Yabur et al., 2005), Michoacán y Veracruz, donde las muestras positivas se asignaron al subgrupo 16SrI-C (Rojas-Martínez et al., 2011).

Además de su detección en México, el grupo 16SrI se ha reportado en papaya en Cuba (Acosta et al., 2011; 2017; Acosta-Pérez et al., 2017), Perú (Hodgetts et al., 2009), Sri-Lanka (Abeysinghe et al., 2014) y China (Yu et al., 2023), mientras que el 16SrXIII solamente en Brasil (Melo et al., 2013). Otros grupos de importancia económica en papaya son 16SrII (por ej. White et al., 1998; Panda et al., 2022), 16SrXII (por ej. Gibb et al., 1996; Barbieri et al., 2023), 16SrXV (Wei et al., 2017) y 16SrXVII (Arocha et al., 2005).

En México, nunca se ha reportado la presencia del grupo 16SrX (PogoshyanMelkonyan et al., 2019), mientras que el 16SrXIII sólo se ha asociado a plantas de papa y jitomate en Sinaloa (Santos-Cervantes et al., 2010) y Baja California Sur (Holguín-Peña et al., 2007). Próximamente, deberá determinarse si el bajo porcentaje de detección de fitoplasmas se debe a la presencia de otros organismos, como rickettsias o virus, que estén induciendo los síntomas estudiados (Davis et al., 1998; Arocha et al., 2003; Acosta et al., 2013; Luis-Pantoja et al., 2015).

En el caso de malezas e insectos, la detección de fitoplasmas fue positiva en tres de 174 (1.7%) y dos de 185 (1.1%) muestras, respectivamente, y con excepción de Ixtlahuacán, los ejemplares positivos se obtuvieron a pesar de no haber registrado fitoplasmas en plantas de papaya (Cuadro 1). Colima fue el único municipio donde no hubo malezas ni insectos positivos a fitoplasmas (Cuadro 1).

Las malezas en donde se detectaron los fitoplasmas fueron asintomáticas, dos de ellas se identificaron como Amaranthus palmeri (Amaranthaceae) (GenBank 16S: PP348062-PP348063, secA: ON303289-ON303290) y la otra como Echinochloa colona (Poaceae) (GenBank 16S: PP348064, secA; ON303291. Los insectos se identificaron como Micrutalis calva (Hemiptera: Membracidae) (GenBank 16S: PP348065, secA: ON303292) y Balclutha mexicana (Hemiptera: Cicadellidae) (GenBank 16S: PP348066, secA: ON303292) (Cuadro 2).

Los análisis RFLPs in silico del gen 16Sr permitieron asignar los fitoplasmas detectados a la especie ‘Ca. Phytoplasma asteris’ (grupo 16SrI, porcentaje de identidad: 99.44-99.68), subgrupos 16SrI-AF (coeficiente de similitud: 1.00) en A. palmeri (muestra 5S), E. colona (muestra 7S) y M. calva (muestra 8S), y 16SrI-B (coeficiente de similitud: 0.98) en A. palmeri (muestra 6S) y B. mexicana (muestra 9S) Cuadro 2).

La detección de fitoplasmas en insectos y malezas asociadas a los agroecosistemas de papaya, sugiere que los artrópodos diseminan las bacterias entre plantas y que las malezas pueden jugar un papel importante como fuente de inóculo (Duduk et al., 2018). Para México, la presente investigación es pionera en indagar si las malezas e insectos asociados a la papaya son portadores/fuente de inóculo de fitoplasmas, siendo la primera vez que se reportan como especies portadoras de fitoplasmas del grupo 16SrI en agroecosistemas de papaya. Las malezas se suman a los registros de las que se han asociado al cultivo de papaya, y que se han reportado como hospedantes de fitoplasmas 16SrII en Cuba y Etiopía, tales como Anoda acerifolia (Malvaceae), Euphorbia heterophylla (Euphorbiaceae), Malvastrum coromandelianum (Malvaceae) y Rhynchosia minima (Fabaceae) (Arocha et al., 2007; Bekele et al., 2011). Aun cuando A. palmeri es una maleza común en diferentes agroecosistemas mexicanos, solo se ha reportado como hospedante de fitoplasmas del grupo 16SrIII como maleza asociada al cultivo de lufa (Luffa acutangula) (Cucurbitaceae) (Santos-Cervantes et al., 2021).

Respecto a los insectos B. mexicana y M. calva, es la primera vez que se registran como portadores de fitoplasmas en agroecosistemas de papaya. Previamen te sólo se había documentado la detección positiva de fitoplasmas en ejemplares del género Orosius en Australia (Padovan y Gibb, 2001), de E. papayae en Cuba (Acosta-Pérez et al., 2010; Acosta et al., 2017) y E. stevensi en Trinidad (Haque y Parasram, 1973). Sin embargo, hasta la fecha, sólo se ha demostrado experimentalmente la capacidad vectorial de E. stevensi en Trinidad (Haque y Parasram, 1973) y de E. papayae en Puerto Rico (Adsuar, 1946) y Cuba (Acosta-Pérez et al., 2010; Acosta et al., 2017).

Sobre Balclutha, en México este género forma parte de la entomofauna en agroecosistemas de Vaccinium corymbosum (Pérez-Mejía et al., 2020), Vitis vinifera (Almendra-Paxtlan et al., 2021), Capsicum annuum (Velásquez-Valle et al., 2018) y Zea mays (Pinedo-Escatel y Moya-Raygoza, 2018), pero ni el género ni alguna especie se han reportado como portadores de fitoplasmas. En otros países, sólo en ejemplares de la especie B. hebe se ha detectado fitoplasmas del grupo 16SrXIII en Brassica oleracea (Canale y Bedendo, 2020), 16SrI en Solanum tuberosum (Girsova et al., 2016), 16SrII en Trigonella foenum-graecum (Malik et al., 2020) y 16SrIX en Prunus dulcis (Dakhil et al., 2011).

Con respecto a Micrutalis, su presencia en México se ha registrado en agroecosistemas de amaranto (Amaranthus hypocondriacus) y Prosopis (Salas-Araiza y Boradonenko 2006), y la especie M. calva en Z. mays (Pinedo-Escatel, 2014). Micrutalis calva posee capacidad vectorial del Tomato pseudo-curly top virus (TPCTV) en jitomate en Florida (Simons y Coe, 1958).

Con base en la importancia que tiene la papaya en México y en otros países donde se cultiva, se determinará próximamente si B. mexicana y M. calva tienen la capacidad de transmitir fitoplasmas en papaya y en las malezas que conforman su agroecosistema.

En este estudio se reporta por primera vez la presencia de fitoplasmas 16SrI-AF, 16SrX y 16SrXIII en plantas de papaya con síntomas de Bunchy Top en agroecosistemas del estado de Colima, México. Los fitoplasmas de los grupos 16SrX y 16Sr-XIII se reportan por primera vez a nivel mundial y en México en papaya, respectivamente. Las malezas Amaranthus palmeri y Echinochloa colona, y los insectos Micrutalis calva y Balclutha mexicana, asociados a los agroecosistemas de papaya, son portadores de fitoplasmas subgrupos 16SrI-AF y 16SrI-B, lo que los constituye nuevos registros como reservorios naturales y potenciales vectores de las bacterias.