Efecto antifúngico del aceite esencial de clavo y sus componentes principales sobre hongos aislados de tortillas de maíz

Aislamiento de hongos en tortillas de maíz

Los paquetes con las tortillas de maíz provenientes de los cinco estados de México se abrieron y se dejaron atemperar a 25 °C. Las muestras se prepararon y se realizaron diluciones según la NOM-110-SSA1-1994, se sembraron en agar papa dextrosa (PDA), las placas se incubaron a 25 °C por 72 h (Secretaría de Salud

de México, 1994). Se sembraron tres muestras por cada paquete de tortillas de maíz por triplicado. Después del periodo de incubación (72 h) se prosiguió a la resiembra de cada colonia fúngica hasta lograr el aislamiento de cada una. Una vez que las colonias fueron aisladas se siguió la técnica de la “cinta adhesiva” y tinción con azul de algodón para observar la estructura fúngica al microscopio óptico Amscope B020c^® a 40 X (Guerra et al., 2019). Para llegar a la identificación de cada género fúngico, se compararon las características macro y micro de cada hongo con la bibliografía reportada (Barupal et al., 2019; Nguyen et al., 2020; Rangel-Muñoz et al., 2020; Yin et al., 2021).

Identificación molecular de hongos

Para la extracción del ácido desoxirribonucleico (ADN) se siguió la metodo- logía que reportaron González-Mendoza et al. (2010). Se recolectó y liofilizó el micelio de cada hongo después de siete días de crecimiento. Se pesaron 20 mg de micelio y se le añadieron 200 µL de Buffer de lisis (SDS 3%, Tris-HCl 0.1 mM, pH 8.0, EDTA 0.5 mM, pH 8.0, NaCl 1 M) y la mezcla se agitó por 30 min. Se adicio- naron 200 µL de cloroformo/fenol (1/1) y se incubó a 65 °C por 5 min en un baño seco, después se centrifugó a 4 °C por 5 min a 10,000 g. El sobrenadante se vertió en otro tubo al que se adicionó el mismo volumen de etanol puro. El contenido se mezcló lentamente, se enfrió a -20 °C por 20 min y centrifugó a 4 °C por 5 min a 10,000 g. Se descartó el sobrenadante, el resto se re-suspendió en etanol al 75% y se centrifugó a 4 °C por 5 min a 10,000 g. Nuevamente se descartó el sobrenadante y al volumen restante se le añadieron 30 µL de agua Millipore^®. Finalmente, se realizó electroforesis en gel agarosa al 1.5% para verificar la extracción de ADN de cada aislado.

Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de punto final para iden-

tificar a cada aislado. Para la amplificación se utilizaron iniciadores con la región interespecífica (ITS)1 (5´-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3´) e ITS4 (5´-TCCTC- CGCTTATTGATATGC-3´). La mezcla final de la reacción fue de 25 µL: 12.5 µL de PCR Master mix (Promega^®), 1 µL de platinum Taq polimerasa (Invitrogen^®),

1.5 µL de ITS1, 1.5 µL de ITS4, 2 µL de ADN y 6.5 µL de agua Millipore^®. La reacción de amplificación se empezó 30 s a 95 °C, seguido por 35 ciclos de la siguiente forma: 1 min a 95 °C, 30 s a 50 °C y 1 min a 72 °C, la fase final duró 5 min a 95 °C (Kim et al., 2020). Cada amplificación se cuantificó, se purificó y se analizó en el laboratorio Nacional de Biotecnología Agrícola Médica y Ambiental ubicado en San Luis Potosí. Las secuencias se compararon con las publicadas en la base de datos del banco de genes del National Center for Biotechology Information (NCBI, 2023).

Concentración mínima inhibitoria (CMI) del AEC frente a los hongos aislados

Para evaluar la CMI de AEC sobre hongos filamentosos, se siguió la propuesta de “Clinical Laboratory Standard Institute” con algunas modificaciones (Standards Clinical and Laboratory Institute, 2018). El AEC comercial utilizado se adquirió de Young Living ®. Se emplearon las siguientes concentraciones de AEC: 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, 400, 800 y 1,600 µg mL^-1 y el medio de cultivo que se uti- lizó fue PDA. Cada aislado fúngico se resembró y al 5^o día de crecimiento se tomó para cuantificar en cámara de Neubauer y se ajustó a 2,500 conidias mL^-1. Una vez que se estandarizó el inóculo, se procedió a depositar 100 µL de AEC y 100 µL de inóculo en tubos eppendorf de 2 mL, por triplicado. Lo anterior se incubó a 25 °C durante 24 h para las especies de Mucor spp. y durante 48 h para el resto de los géneros fúngicos. Después del tiempo de incubación se cuantificaron las unidades formadoras de colonia (UFC) por vaciado en placa y la concentración en la cual no se observó crecimiento fúngico se tomó como CMI y se reportó como µg mL^-1 para 250 conidias.

Efecto del AEC, E, I y AE sobre el crecimiento micelial de Aspergillus niger

Uno de los hongos aislados por su prevalencia (Aspergillus niger) se eligió para evaluar el efecto de AEC, E, I y AE sobre su crecimiento micelial. Para este ensayo se siguió el procedimiento de Díaz-García et al. (2024) con algunas modificacio- nes. Inicialmente, se estandarizó el inóculo a una concentración de 1×10⁶ esporas mL^-1. De éste se tomaron 100 µL equivalentes a 100,000 conidias, las cuales se depositaron en un pocillo de 0.9 cm de diámetro ubicado en el centro de cada pla- ca Petri con PDA. Posteriormente, en un segundo pocillo se depositaron 100 µL de cada uno de los agentes antifúngicos AEC, E, I y AE a cuatro concentraciones (2,000, 4,000, 8,000 y 16,000 µg mL^-1), de tal modo que se evaluó un compuesto y una concentración por placa Petri y por triplicado. Además, se incluyeron un control con agua y otro con etanol puro para descartar la posible actividad antifún- gica del diluyente. Todas las placas se incubaron a 25 °C durante 96 h, se midió el diámetro del micelio cada 12 h durante las primeras 48 h y después cada 24 h. Se consideró que las mediciones finales serían un día después de que los diámetros de los controles agua y etanol comenzaran a estacionarse. La medición de cada diá- metro del micelio se realizó en la dirección vertical de los pocillos, iniciando en el límite derecho de pocillo central y hasta el límite izquierdo hasta donde se extendió el crecimiento del hongo. Los resultados del crecimiento micelial y el porcentaje de inhibición de cada compuesto se calcularon con las ecuaciones 1 y 2:

Los parámetros cinéticos (λ: fase de latencia, μm: velocidad máxima de creci- miento, A: crecimiento máximo del hongo en la fase estacionaria) del efecto de AEC, E e I se estimaron con la herramienta DMFit de Excel. La herramienta se alimentó con los datos del diámetro micelial (cm) que se obtuvieron en cada trata- miento y cada tiempo de muestreo (12, 24, 48, 72 y 96 h). El modelo de Gompertz permite obtener cada variable cinética y comparar el efecto de cada compuesto sobre λ, μm y A. El modelo de Gompertz se basa en la ecuación 3 (Bevilacqua et al., 2015; Soro et al., 2021; Zwietering et al., 1990).

Ecuación 3

Donde y es el diámetro micelial en un tiempo determinado de incubación, t es tiempo y μm es la velocidad de crecimiento máximo, λ es la fase de latencia y A es el crecimiento máximo del hongo en la fase estacionaria. Las fases de latencia (λ) y crecimiento máximo del hongo en la fase estacionaria (A) se analizaron en el paquete estadístico NCSS 2023 y se realizó una comparación de medias por Tukey- Kramer (p≤0.05) (NCSS, 2023).

Aislamiento e identificación de hongos en tortillas de maíz

Uno de los dos aislados fúngicos de las tortillas de maíz de Monterrey, Nue- vo León (N.L.) (Figura 1B), Hermosillo, Son (Son) (Figura 1H), Mérida, Yucatán (Yuc) (Figura 1E) y el único aislado de Oaxaca, Oaxaca (Oax) (Figura 1C), se observaron similitudes morfológicas al género de Aspergillus. Este género se ca- racteriza por tener hifas hialinas en las que se encuentra un conidióforo circular uniforme, el cual presenta conidias en toda su superficie, las que se desprenden para formar otra colonia fúngica. La coloración de las colonias de Aspergillus spp. en medio de cultivo gelificado puede ser blanca, negra o verde (Figura 2 B, C y E) (Ibarra-Valenzuela, 2019; Rangel-Muñoz et al., 2020).

Por otro lado, un aislado fúngico (de dos) de las tortillas provenientes de More- lia, Michoacán (Mich) y Hermosillo, Son (Figuras 1A y 1D, respectivamente), se encontró la presencia del género Penicillium. Las colonias suelen ser planas ater- ciopeladas con circunferencia blanca en colores verdes que se tornan café oscuro durante su maduración (Ibarra-Valenzuela, 2019; Yin et al., 2021).

También se encontró Curvularia en uno de los dos aislados de las tortillas de Monterrey, N.L. (Figura 1G). Este género presenta hifas septadas con microconi- dias ovalados y macroconidias de 3 a 5 divisiones en forma curva. Las colonias de estos géneros van desde verde oliváceo a marrón oscuro y se consideran dema- tiáceos debido a que poseen una coloración café debido a la producción propia de melanina (Barupal et al., 2019).

Mucor spp. se encontró en uno de los dos aislados de las tortillas provenientes de Morelia, Mich (Figura 2F) y Mérida, Yuc (Figura 2I). Este género presenta hifas hialinas que se encuentran unidas al conidióforo circular uniforme y a diferencia del resto de hongos mencionados, produce y conserva a cada conidia dentro del conidióforo. Una vez que el conidióforo llega a su punto máximo de maduración es cuando la pared celular de este se rompe y libera cada conidia para formar una colonia nueva. Las colonias de este género fueron algodonosas de color café a gris

y con la característica de llenar completamente la placa de cultivo en un periodo máximo de 48 h, además, debido a su rápida proliferación la mayoría de pruebas que se le realizan deben hacerse a las 24 h (Nguyen et al., 2020).

Identificación molecular de hongos aislados de tortillas de maíz

Durante la amplificación de las ITS se obtuvieron fragmentos de ADN con un tamaño de entre 500 y 750 pb. Las secuencias que se obtuvieron corroboraron el género de cada hongo, además permitió conocer la especie de cada uno. Se identi- ficaron a M. racemosus y P. herquei en los aislados de Morelia Mich con un 100 % de identidad. Posteriormente se identificaron a A. longivesica y C. spicifera en los aislados de Monterrey, N.L. con un 100 % de identidad. Después se identificaron a A. niger y P. brevicompactum en los aislados de Hermosillo, Son con un 100 % de identidad. Se identificó a A. flavus en uno de los dos aislados de Mérida, Yuc con un 94.23 % de identidad, mientras que la secuencia del segundo aislado que corresponde a Mucor sp. no se encontró en la base de datos del NCBI. Finalmente, el aislado de Oaxaca, Oax que se identificó como Aspergillus sp. no logró amplifi- carse con los ITS’s utilizados.

CMI del AEC frente a los hongos en las tortillas de maíz

Las CMIs de los hongos aislados de Michoacán, Nuevo León, Oaxaca, Sonora y Yucatán fueron desde los 200 hasta los 800 µg mL^-1, esta cantidad corresponde de 20 a 80 µg de AEC añadido para inhibir el crecimiento de 250 conidias (Cuadro 1). El hongo menos resistente a AEC fue A. longivesica ya que solo requirió de 200 µg mL^-1 para inhibir su crecimiento, después, M. racemosus, P. herquei, C. spicifera

y P. brevicompactum con una CMI de 400 µg mL^-1. Finalmente, los hongos más resistentes a AEC fueron Aspergillus sp., A. niger, A. flavus y Mucor sp. con una CMI de 800 µg mL^-1. Aspergillus sp. fue el género más prevalente en las tortillas de maíz y, además, el género más resistente a AEC con la CMI más alta. Por lo que, el control de este género es fundamental para garantizar la seguridad y calidad de las tortillas de maíz.

Efecto del AEC, E, I y AE sobre el crecimiento micelial de Aspergillus niger

Posterior al periodo de incubación se observó que AEC (4,000 y 2,000 µg mL^-1) presentó el mismo efecto fungistático que E (8,000, 4,000 y 2,000 µg mL^-1) e I (16,000, 8,000, 4,000 y 2,000 µg mL^-1) a las 24 h, estos se encuentran en mayor proporción en este aceite (Figura 3). El mayor porcentaje de inhibición lo produjo AEC a 16,000 µg mL^-1, el efecto fungicida de esta concentración se mantuvo por al menos 96 h (Figura 4). El AEC (16,000 y 8,000 µg mL^-1) y E (16,000 µg mL^-1) produjeron los mayores porcentajes de inhibición (100, 57.1 y 67.3 %), respecti- vamente. La inhibición de AEC (4,000 µg mL^-1, 27.6%), E (8,000 µg mL^-1, 34.7% y 4,000 µg mL^-1, 21.4%) e I (16,000 µg mL^-1, 22.4% y 8,000 µg mL^-1, 22.4%) no

presentaron diferencias significativas entre sí. Mientras que, la adición de AEC y E (16,000 µg mL^-1) disminuyeron cinco y seis veces la velocidad de crecimiento de Aspergillus niger respecto a los controles de agua y etanol, respectivamente. Por otro lado, ninguna de las concentraciones de AE presentaron un efecto antifúngico sobre el crecimiento micelial de A. niger.

Aislamiento e identificación de hongos en las tortillas de maíz

Las tortillas de maíz son un alimento de consumo diario en todo México; sin embargo, existe escasa evidencia sobre especies fúngicas que limitan su vida de anaquel. El desarrollo fúngico de Aspergillus spp. y Penicillium spp. en alimentos es importante porque estos producen diversas micotoxinas. La incidencia de estos hongos en el maíz no se elimina con las condiciones de procesamiento de las torti- llas, por lo que se desarrollan una vez que se adaptan a las condiciones de almace- namiento del producto a nivel doméstico.

Aspergillus spp. y Penicillium spp. se encuentran en el maíz desde la cosecha (Ullah et al., 2010), mientras que Curvularia spp. y Mucor spp. se relacionan a una contaminación durante el proceso de elaboración del alimento, por lo que pueden contaminar las tortillas al momento de ser envasadas. Curvularia spp. no se habían

relacionado con las tortillas de maíz o pérdida de la vida de anaquel de este alimen- to, pero si como causantes de infectar al grano de maíz, mientras que, Mucor spp. se identificó en tortillas de maíz elaboradas a partir de cinco razas diferentes de maíz (López-Morales et al., 2023). Curvularia spp. se asocia con la contaminación de almacenes y silos para granos de maíz, por su parte Mucor spp. ha sido aislado de silos con granos de maíz durante su almacenamiento, ya que este último es conside- rado un género fúngico contaminante del ambiente y no propio del maíz (Akwuobu et al., 2019; García-Leaños et al., 2007).

CMI del AEC frente a los hongos en tortillas de maíz

El efecto antifúngico del AEC se debe a los componentes terpénicos contenidos en este aceite, específicamente E e I son compuestos con carácter lipofílico que mo- difican la membrana fúngica e interrumpen el intercambio de iones, lo que produce lisis celular (de Oliveira Pereira et al., 2013). Los resultados de la CMI (200-800 µg mL^-1) que se obtuvieron para Penicillium spp. y Aspergillus spp. frente a AEC se encuentran en la misma magnitud de la CMI (350-400 µg mL^-1) que reportaron para Aspergillus sp. y para Penicillium sp. frente a E (Abbaszadeh et al., 2014). Para Curvularia spicifera no se encontraron reportes comparables con el AEC, pero si con otros aceites esenciales, por ejemplo, el aceite de Psidium guajava (0.2 %) que tiene limoneno (29 %) y cariofileno (15%) en mayor proporción, este aceite inhibió el 53 % de Curvularia Lunata (Chaturvedi et al., 2019). Heer et al. (2017) evaluaron el efecto de Cinnamomum tamala que contiene E (52%) frente a Curvu- laria lunata, la CMI del extracto frente a Curvularia lunata fue de 2,117 µg mL^-1. Hasta el momento no existen reportes sobre el efecto de AEC, E, I o AE frente a Mucor spp. que hayan empleado la técnica descrita en la sección de materiales y métodos, pero si existen dos reportes de la CMI de E frente a Rhizopus oryzae, la cual fue de 512 µg mL^-1 (Prajapati et al., 2023) y 350 µg mL^-1 (Abbaszadeh et al., 2014). Debido a la importancia de mantener alimentos libres de cualquier hongo y sus metabolitos secundarios, es importante tener una alternativa natural como el AEC para disminuir el desarrollo de estos en alimentos. Los resultados de la CMI del AEC frente a cada especie fúngica sugieren que 1,600 µg mL^-1 son suficientes para ejercer una actividad fungicida en cada caso.

Efecto del AEC, E, I y AE sobre el crecimiento micelial de Aspergillus niger

El crecimiento de los diámetros de los controles (agua y etanol) disminuyeron a las 72 h, por lo que se consideró terminar las mediciones a las 96 h. Aspergillus niger empezó a desarrollarse en los controles de agua y etanol a las 17 y 22 h, respectivamente; mientras que en AEC (16,000 µg mL^-1) y en E (16,000 µg mL^{- 1}) tardaron ≥96 y 87.43 h, respectivamente. La concentración más alta de AEC

impidió el crecimiento del hongo durante todo el periodo de incubación (96 h). Pereira et al. (2013) y Tarhan (2021) reportaron que el efecto antifúngico de AEC se debe a E, puesto que se encuentra en mayor proporción en este aceite. No obs- tante, los resultados obtenidos sobre el efecto de AEC, E e I en el crecimiento de Aspergillus niger, sugieren que existe un mayor efecto antifúngico por AEC que por E e I separados en las mismas concentraciones. Esto ocurre porque en AEC se dan los mecanismos de acción de E e I que ejercen un efecto sinérgico, es decir, por su lado E se reporta que interacciona con la molécula de ergosterol en la membrana fúngica, mientras que I inhibe la formación de componentes de la matriz extrace- lular fúngica (Gupta et al., 2022; Pereira et al., 2013). Los grupos hidroxilos de E e I promueven un efecto antifúngico sinérgico cuando se encuentran combinados en AEC. Consecuentemente, al aplicar una concentración menor de AEC (4,000 µg mL^-1) se obtiene el mismo efecto sobre la fase de latencia (λ) que al adicionar una concentración mayor de E (8,000 µg mL^-1) o I (16,000 µg mL^-1) por separado (Cuadro 2).

Los controles de agua y etanol empezaron a desarrollarse al mismo tiempo que

las bajas concentraciones de AEC y E; sin embargo, estas concentraciones disminu-

yeron la velocidad de crecimiento de Aspergillus niger desde 1.6 hasta a 2.3 veces respecto al control de agua. Esto muestra que la adición de AEC y E a bajas concen- traciones tienen un mayor impacto sobre la velocidad de desarrollo y sobre el diá- metro máximo del hongo comparado con el impacto que ejercen sobre el tiempo de adaptación durante el periodo de incubación. Es decir que bajas concentraciones de estos compuestos tienen un mayor efecto en el desarrollo de hifas y conidióforos, comparado con el menor efecto que ejercen sobre las conidias del hongo. Al escalar la posible adición de AEC como aditivo alimentario, es justo mencionar que este compuesto podría tener la capacidad para disminuir la velocidad de crecimiento de los hongos presentes en las tortillas de maíz. La adición de AEC (8,000 µg mL^-1) en tortillas de maíz podría prolongar su vida de anaquel por lo menos 63 h más a temperatura ambiente, puesto que este tratamiento retrasa el desarrollo del hongo durante este tiempo. Los ensayos del efecto antifúngico se realizaron a 25 °C y las tortillas de maíz se almacenan a 5 °C, por lo que la adición de AEC en este alimento en conjunto con las bajas temperaturas de su almacenamiento podrían potenciar el efecto antifúngico que podría prolongar la vida de anaquel de las tortillas de maíz por un tiempo mayor a 63 h.

El efecto de AEC, E e I sobre el crecimiento máximo de Aspergillus niger pre-

sentaron un comportamiento diferente en la fase de latencia (λ). Después de las 96 h de incubación AEC (16,000 y 8,000 µg mL^-1) y E (16,000 µg mL^-1) presentaron mayor efecto antifúngico (p≤0.05) sobre el crecimiento máximo del hongo en la fase estacionaria (A). Lo anterior, seguido de AEC (4,000 µg mL^-1), E (8,000 y 4,000 µg mL^-1), I (16,000, 8,000 y 4,000 µg mL^-1) similares entre sí. Finalmente, AEC (2,000 µg mL^-1), E (2,000 µg mL^-1), I (2,000 µg mL^-1), agua y etanol no pre- sentaron diferencias significativas entre sí (p>0.05). Los resultados sugieren que cada molécula cumple una función en el efecto antifúngico frente a Aspergillus niger, aunque en la fase de latencia (λ), I (8,000 µg mL^-1) no presenta diferencias con respecto a E (8,000 µg mL^-1). Una vez transcurren 22.04 h el efecto antifúngico disminuye. Consecuentemente a las 96 h el crecimiento máximo del hongo en la fase estacionaria (A) en I (8,000 µg mL^-1) es similar a AEC (2,000 y 4,000 µg mL^{- 1}) y es mayor a AEC (8,000 µg mL^-1) y E (8,000 µg mL^-1). La fase de latencia (λ) es importante en el estudio del efecto antifúngico de AEC sobre Aspergillus niger, pero tiene mayor importancia sobre el crecimiento micelial, puesto que al reducir el crecimiento de hifas se puede reducir la producción de micotoxinas presentes (Hua et al., 2014; Mirza Alizadeh et al., 2022). Allam et al. (2012) reportaron una disminución de crecimiento micelial y erradicación del 100% de ocratoxina A, mi- cotoxina producida por Aspergillus niger, al usar una concentración de 250 µL L^-1 de AEC.

Previo a la búsqueda de compuestos naturales como el AEC para el control fún-

gico en alimentos, se han utilizado diversos conservadores convencionales como

los sorbatos y propionatos para controlar el desarrollo de hongos y la producción de micotoxinas en tortillas de maíz. La NOM-247-SSA1-2008 establece el límite máximo de algunos conservadores para tortillas de maíz como el ácido sórbico (1,000 mg kg^-1) y el ácido benzoico (1,000 mg kg^-1) (Secretaría de Salud de México, 2009). Mientras que el “Acuerdo por el que se determinan los aditivos y coadyu- vantes en alimentos, bebidas y suplementos alimenticios, su uso y disposiciones sanitarias” (Diario Oficial de la Federación de México, 2012) publicó una lista de aditivos para diversos alimentos. Ésta establece el límite máximo a añadir de otros conservadores como el benzoato de calcio (1,000 mg kg^-1) y sorbato de potasio (2,000 mg kg^-1) en tortillas preenvasadas. La adición de cada conservador y su consumo prolongado puede tener efectos adversos a la salud, por ello, una alterna- tiva natural puede ser la adición de compuestos naturales como el AEC. Tratando de hacer una equivalencia, el tratamiento de AEC (8,000 µg mL^-1) en placas de PDA (15 g de agar) resulta en una concentración menor (53.3 mg kg^-1) a la con- centración máxima de conservadores artificiales establecida para tortillas de maíz (1,000-2,000 mg kg^-1). Por lo tanto, el AEC podría ser una alternativa natural para disminuir el crecimiento de hongos en las tortillas de maíz y con ello prolongar su vida de anaquel.

En este estudio se identificó la presencia del género Aspergillus en tortillas de

maíz, en la industria de las tortillas de maíz se aplican aditivos artificiales princi- palmente sorbato de potasio y propionato de sodio; sus límites permitidos se en- cuentran en normas oficiales mexicanas (Secretaría de Salud de México, 2009). La incorporación de cualquier aditivo es capaz de modificar las características propias del alimento y la tortilla no es la excepción, ya que la adición de sorbatos o propio- natos causa que esta cambie, dependiendo de la concentración de aditivos alimen- tarios, puede modificar su sabor y color (Báez‐Aguilar et al., 2022). La Secretaría de Salud de México, (2002) incluye el límite máximo permitido para el sorbato de potasio en las tortillas de maíz o harinas de maíz el cual indica un límite de 2,000 mg kg^-1; sin embargo, en 2002 se evaluó la concentración de aditivos en harinas de maíz comerciales y se encontró que la harina de maíz MASECA^® contenía 4,000 mg kg^-1 de sorbato de potasio (Flores Farías et al., 2002).

Debido a las modificaciones que sufren las tortillas de maíz al ser aditivadas con conservadores artificiales como el sorbato de potasio y los efectos adversos a la salud por su consumo es que se buscan compuestos naturales que ejerzan la misma propiedad antimicrobiana (Jarkvist et al., 2020; Pepper et al., 2020). En el presente trabajo se encontró que se requieren concentraciones de AEC inferiores al límite permitido de conservadores artificiales (sorbato de potasio, 2,000 mg kg^-1) para disminuir la velocidad de crecimiento máximo (μm) y disminuir el crecimiento

máximo del hongo en la fase estacionaria (A). Además, la dosis mínima letal me-

dia aguda oral (DL 50) de AEC (5,000 mg kg^-1) es superior al DL 50 de E (1,930

mg kg^-1) e I (1,560 mg kg^-1), es decir, se necesita ingerir una mayor cantidad de AEC para que pueda ocasionar algún efecto secundario, por lo que AEC podría ser una alternativa con menor toxicidad (Parvitra, 2024; Roth, 2024). Con respecto al precio del AEC en el mercado (MXN$3.7/g), es 2.3 y 4.1 veces menor respecto al precio de E e I (MXN$8.6/g y MXN$15.2/g), respectivamente (Sigma-Aldrich, 2023a, 2023b, 2023c). Lo anterior muestra que AEC es más asequible y con mayor efecto antifúngico que E o I, por lo que tiene una mayor capacidad para disminuir la cantidad de hongos presentes y prolongar la vida de anaquel de las tortillas de maíz.