Identificación de marcadores moleculares asociados con genes de resistencia a Puccinia triticina

Introducción

La roya de la hoja causada por Puccinia triticina continúa siendo una de las enfermedades más importantes del trigo (Triticum aestivum) en México. Uno de los métodos de control más económico y ambientalmente apropiado es el uso de variedades resistentes. Dentro de las poblaciones de este fitopatógeno, las razas fisiológicas que preferentemente atacan trigos cristalinos han evolucionado más rápidamente que aquellas que atacan a los trigos harineros. Por ejemplo, en 2001, se identificó la raza BBG/BP (Singh et al., 2004) virulenta al gen de resistencia Lr72 (Herrera-Foessel et al., 2014a) que posteriormente evolucionó y originó la raza BBG/BP para virulencia a Lr27+31 (Huerta- Espino et al., 2009) y eventualmente el hongo causante de la enfermedad evolucionó para vencer el gen de resistencia presente en la variedad Cirno C2008 (Huerta Espino et al., 2017, Huerta-Espino et al., 2024). Sin embargo, entre las razas que preferentemente atacan trigos harineros, la evolución ha sido lenta en las últimas dos décadas en parte debido al tipo de resistencia usada en el proceso de mejoramiento.

La resistencia generalmente se clasifica en dos tipos no excluyentes, de raza específica y de raza no específica (Caldwell, 1968), equivalentes al concepto de resistencia vertical y horizontal (Vanderplank, 1963). La resistencia de raza no específica, también se identifica como resistencia parcial en el tizón tardío de la papa (Solanum tuberosum L.) (Niederhauser et al.,1954), resistencia parcial a roya de la hoja en cebada (Hordeum vulgare L.) (Parlevliet,1975), enroyamiento lento (“Slow Rusting”) a la roya de la hoja del trigo (Triticum aestivum L.) (Caldwell, 1968), o resistencia durable a la roya amarilla del trigo (Johnson, 1978). La resistencia de raza específica es generalmente cualitativa y suele ser de corta duración debido a la evolución de patógenos potencialmente virulentos (Huerta- Espino et al., 2011). Por el contrario, niveles adecuados de resistencia de raza no específica (cuantitativa) involucra genes de efectos menores a intermedios, de manera que, las plantas portadoras de este tipo de resistencia son susceptibles en la etapa de plántula, pero expresan resistencia en las etapas posteriores de crecimiento (planta adulta). Esta característica se denomina resistencia de desarrollo lento y se asocia con algunas formas de resistencia de planta adulta (Lagudah, 2011). Se ha observado que se puede obtener casi-inmunidad a los hongos causantes de royas conjuntado genes menores de efectos aditivos (Singh et al., 2000). Los genes más importantes pertenecientes a la categoría de "desarrollo lento" o "resistencia de planta adulta (RPA) son: Lr34 (Singh et al., 2012), Lr46 (Singh et al., 2013), Lr67 (Herrera-Foessel et al., 2014b) y Lr68 (Herrera-Foessel et al., 2012), estos genes están asociados con la necrosis de la punta de la hoja (Ltn), un rasgo morfológico que se observa después de la floración (Huerta-Espino et al., 2020). Recientemente se ha descubierto que el gen Sr2 que proporciona resistencia a la roya del tallo está asociado con un gen que confiere resistencia a la roya de la hoja denominado temporalmente LrB1 (Ye et al., 2022). En México se ha puesto énfasis en los genes que confieren resistencia parcial en planta adulta desde la década de 1950 (Huerta-Espino et al., 2020). Con base en marcadores moleculares, un estudio reciente indicó la presencia de Lr34, Lr46, Lr67, Lr68 y Sr2/LrB1, solos o en diferentes combinaciones, en los genotipos de trigo mejorados antes de la revolución verde, como Frontera, Supremo 211, Chapingo 48, Yaqui 50, Kentana 52, Bajío

52, Bajío 53, Yaqui 53, Chapingo 53, Mayo 54; en sus descendientes, los trigos semi- enanos, desarrollados después de cruzamientos, y por recombinación de estos progenitores, en variedades de reciente liberación (Huerta-Espino et al., 2020).

Tomando en cuenta la importancia de la roya de la hoja y la disponibilidad de marcadores moleculares asociados con genes de resistencia parcial, el objetivo del presente estudio fue determinar la presencia de estos marcadores en líneas avanzadas de trigo y variedades de reciente liberación.

Materiales y Métodos

Material genético. Los genotipos de trigo utilizados en este estudio se enumeran en el Cuadro 1.

Pruebas de resistencia. La prueba de resistencia en plántula se realizó en el Laboratorio Nacional de Royas y otras Enfermedades de Cereales (LANAREC). Se utilizó la raza de roya de la hoja MBJ/SP cuya fórmula de avirulencia/virulencia es: Lr2a, 2b, 2c, 3ka, 9, 16, 18, 19, 21, 24, 25, 26, 28, 29, 30, 32, 33, 36/1, 3, 3bg, 10, 11, 13, 15, 17, 20, 23, 27+31

(Herrera-Foessel et al., 2012). Para este ensayo se colocaron de 8 a 10 semillas de cada genotipo en charolas de plástico utilizando como sustrato tierra estéril, también se incluyeron las líneas diferenciales de roya de la hoja (Huerta-Espino et al., 2021). Trece días después de la siembra las plantas se inocularon con una suspensión de urediniosporas de la raza en aceite mineral (Soltrol 170®) en una concentración de 5 mg de urediniosporas por mL de aceite (Randhawa et al., 2018) y se asperjaron con un atomizador conectado a un compresor eléctrico (Valdez-Rodríguez et al., 2020).

En planta adulta, la evaluación se realizó en campo en condiciones de temporal donde se establecieron los 34 genotipos de trigo harinero (Cuadro 1) durante el ciclo primavera- verano 2022 en el Campo Experimental Valle de México del INIFAP (INIFAP- CEVAMEX). En la evaluación en campo los 34 genotipos se sembraron en dos surcos de 1 m de longitud con dos repeticiones. Los genotipos se inocularon directamente con la raza MBJ/SP 45 días después de la siembra, preparando una suspensión de urediniosporas en aceite mineral (5 mg de urediniosporas mL-1 de aceite) (Randhawa et al., 2018) y asperjada con un atomizador manual. Las evaluaciones de severidad en la hoja bandera se realizaron siguiendo una escala que va de 0 a 100 % (Huerta-Espino et al., 2014).

Análisis molecular. Los 34 genotipos listados en el Cuadro 1 fueron sembrados siguiendo el mismo procedimiento que las pruebas de plántula incluyendo los testigos respectivos para cada gen de resistencia.

El análisis molecular se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología del Programa de Mejoramiento Molecular de Trigo en el Centro Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT). Para la extracción de ADN se recolectaron porciones de tejido foliar y se colocaron en tubos de 1.1 mL en placas de 96 pozos; posteriormente, se almacenaron a -80 °C durante 3 h, después se transfirieron a un liofilizador y mantuvieron a temperatura de -50 ºC a un nivel de vacío de 0.0 a 0.120 mbar por 48 h. El tejido se molió colocando balines de 4 mm por 2 o 3 min hasta obtener polvo, se empleó un molino Geno Grinder® (Metuchen, NJ, EUA). La cuantificación y valoración de la calidad del ADN se realizó de acuerdo con los protocolos de laboratorio para trigo descritos por Dreisigacker et al. (2016) y Valdez-Rodríguez et al. (2020).

Ensayo molecular de genotipado de genes de enroyamiento lento. Se utilizaron marcadores moleculares para determinar la presencia de los alelos de resistencia de los genes Lr34, Lr46, Lr67, Lr68 y Sr2/LrB1 (Cuadro 2). Para Lr34 se utilizó un marcador SNP diseñado alrededor del indel de 3 pb en el exón 11. El gen Lr46 aún no está clonado, por lo que no se disponía de marcadores funcionales. Por tanto, se usaron dos marcadores SNP en las proximidades de Lr46. Para Lr67, se aplicaron dos marcadores de diagnóstico SNP. Los marcadores incluyeron el SNP funcional observado en el exón 2 del gen (SNP_TM4). Se utilizó un marcador SNP derivado del marcador CAPS vinculado, cs7BLNLRR, para determinar el alelo de resistencia para el gen Lr68. Al igual que Lr46 y Lr68, el gen Sr2/LrB1 aún no se ha clonado y los marcadores funcionales no están disponibles. Para determinar el alelo de resistencia para Sr2/LrB1 se aplicó un SNP diseñado en base al marcador CAPS vinculado csSr2.

Los polimorfismos de SNP se detectaron utilizando reactivos de PCR Kompetitive Allele Specific (KASP) (www.lgcgenomics.com) en reacciones que contenían 2.5 μl de agua, 2.5 μl de mezcla de reacción 2×KASPar, 0.07 μl de mezcla de reacción y 50 ng de ADN. En el caso del marcador para Sr2/LrB1 se le adicionaron 2.5 μl MgCl2. El programa para la PCR fue una desnaturalización inicial a 94 °C por 15 min, seguido de 20 ciclos de 94 °C durante 10 s, 57 °C durante 5 s y 72 °C durante 10 s que luego fueron seguidos por 18 ciclos de 94 °C durante 10 s, 57 °C durante 20 s y 72 °C durante 40 s. La fluorescencia se leyó como lectura del punto final a 25 °C. Se utilizó un lector de placas fluorescentes BMG Pherastar Plus (BMG LABTECH, Ortenberg, Alemania) para la lectura de los productos de PCR y posteriormente los datos genotípicos se observaron gráficamente con el Software KlusterCallerTM (LGC Biosearch Technologies).

Resultados y Discusión

Los resultados de plántula en el invernadero en respuesta a la raza MBJ/SP permitieron identificar genotipos susceptibles y genotipos resistentes. Los genotipos resistentes en plántula mantuvieron su resistencia en planta adulta en respuesta a la misma raza con excepción de Kronstand y Faisán S2016 (Cuadro 3). Los genotipos susceptibles en plántula tuvieron un comportamiento diferencial en el campo desde 1 % de infección en Borlaug y Bacorehuis, hasta niveles altos de 50 % en Cortázar S94 y Bárcenas S2002 que se consideran como susceptibles (Cuadro 3).

De los cinco genes de resistencia analizados con los marcadores moleculares se identificó a Lr34, Lr46, Lr68 y LrB1. El gen Lr67 no se detectó en ninguno de los genotipos (Cuadro 3). El marcador asociado con Lr34 solo se identificó en siete de los 34 genotipos, siendo éste el menos frecuente. El marcador asociado con Lr46 por otro lado, estuvo presente en todos los genotipos evaluados, se detectó sólo en la variedad Kronstad y la línea avanzada B, así como, en combinación con el marcador de Lr34 en Texcoco F2016 y con el de Lr68 en la línea avanzada A (Cuadro 3). En combinación con LrB1 el marcador asociado con Lr46 se identificó en 26 de los genotipos, de los cuales en 13 fueron combinaciones de Lr46, Lr68 y LrB1 (Cuadro 3). Otra combinación de tres genes (Lr34, Lr46 y Lr68), solo se identificó en Valles F2015, Urbina S2007 y la línea avanzada D. En la variedad Norteña F2007, se identificaron los marcadores asociados con Lr34, Lr46, Lr68 y LrB1 siendo este el único genotipo en donde se observó la presencia de cuatro de los cinco marcadores usados en el estudio.

Los genotipos que fueron resistentes en plántula contra de la raza MBJ/SP de P. triticina, mantuvieron sus niveles de resistencia en campo en contra de la misma raza con excepción de Kronstand que posee el gene Lr16 el cual sólo confiere una resistencia moderada a P. triticina raza TCB/TD y en planta adulta se comporta como un gen de resistencia parcial con una severidad final de la roya de la hoja de 70 a 80 % cuando el gene se encuentra solo (Singh y Huerta-Espino, 1995). En otras variedades como Francolin el efecto de Lr16 es menor y los niveles de resistencia se incrementan cuando otros genes de raza no-específica (Lan et al., 2014) están presentes, como es el caso de Kronstand con la presencia de Lr46.

Para el caso de Lr16 se han usado ciertos marcadores moleculares incluyendo Lr16/Xgwm210 (Lan et al., 2014), cuando este marcador se usó en el presente estudio (no se muestran datos) solo coincidió con los tipos de infección y previa postulación del gene Lr16 (Huerta-Espino et al., 2021) en Nana F2007, Don Carlos M2015 y Luminaria F2012,

pero no se encontró asociación en el caso de Onavas F2009, Faisán S2016 y Cisne F2016 y fueron falsos positivos en el caso de Roelfs F2007, Borlaug 100 y Noreste F2018.

En el caso de los genotipos susceptibles a MBJ/SP en estado de plántula su respuesta en planta adulta se puede explicar por la asociación de los marcadores moleculares con los genes de resistencia que incluyen Lr34, Lr46 Lr68 y LrB1 solos o en combinación. Sin embargo, la presencia de estos genes solos o en combinación no explica del todo el comportamiento de los genotipos en evaluación. Se esperaría que a mayor número de genes de planta adulta, los niveles de infección serían más bajos, pero no fue el caso de la línea avanzada B (KACHU/DANPHE) con solo Lr46 o en el caso de Cortázar S94 y Bárcenas S2002, donde además de Lr46 se identificó el marcador asociado con LrB1 y solo se cumpliría el supuesto en el caso de las líneas avanzadas C = (ND643/2*WBLL1/4/WHEAR/KUKUNA/3/C80.1/3*BATAVIA//2*WBLL1), D = [(Lucía “S” ) = ZCT/SLM//CHAZ/ /3/KITE/BOW”S”//MEX/ROM], E = [PAMDOLY-

PABG (C7).3,] y F = [PAMDOLY-PABG (C7).1] y de Norteña F2007. Esto indicaría que además de los genes identificados con los marcadores moleculares usados, existen en estos genotipos otros genes de resistencia aún no catalogados y con posibles efectos aditivos por los bajos niveles de infección mostrados en campo en planta adulta. Otros estudios con marcadores moleculares asociados con genes de resistencia parcial o slow rusting han sido reportados, por ejemplo, Lr46 en Guarina y Huites (Huerta-Espino et al., 2020). Lr46+Sr2/LrB1 en Jaral 66, Curinda y Batan (Huerta-Espino et al., 2020). Aun cuando Lr67 junto con Lr46 y Lr68 fue común en variedades de los 50’s, no se identificó en las variedades semi-enanas y no se ha encontrado en combinación con Lr34 (Huerta-Espino et al., 2020), e inclusive no se identificó en el presente estudio. La asociación del gene de resistencia Sr2 que confiere resistencia parcial a la roya del tallo recientemente se encontró que también confiere resistencia parcial a la roya de la hoja (Diéguez et al., 2014) (y designado como LrB1), aunque en menor grado que los genes previamente reportados como Lr34, LR46, Lr67 y Lr68 (Ledesma-Ramírez et al., 2018 y Huerta-Espino et al., 2020); sin embargo, se ha reportado que el QTL en el cromosoma 3BS, mapeado a la región genómica Sr2/LrB1 (Ye et al., 2022), es un locus único que confiere resistencia a roya de la hoja a las razas presentes en las diferentes localidades y años donde poblaciones de mapeo han sido probadas (Rauf et al., 2022). Se ha reportado que con la combinación de LrB1 y Lr46 los niveles de infección de roya de la hoja se reducen hasta en un 45 % (Ye et al., 2022). Aun cuando se ha demostrado que la estrategia de conjuntar varios genes de resistencia parcial es la más efectiva para controlar la roya de la hoja del trigo (Singh et al., 2000), en la práctica solo en las variedades Norteña F2007 se han podido conjuntar los genes Lr34, Lr46, Lr68 y LrB1, (presente estudio) con ausencia de Lr67.

Los resultados del presente estudio indican una disminución de la frecuencia de Lr34 y un aumento considerable de Lr46. Con la disponibilidad de los marcadores moleculares asociados con los genes de resistencia, se esperaría un incremento del número de genes de resistencia a la roya o por lo menos se deberían mantener cierto número de combinaciones. Sin embargo, los programas de mejoramiento necesitan seleccionar y priorizar qué genes deben implementarse o qué combinaciones tienen mayor probabilidad de proporcionar resistencia durable contra el hongo causante de roya de la hoja y así reducir la presión de selección sobre el patógeno y, por lo tanto, limitar la emergencia de nuevas razas. Los resultados del presente estudio respaldarían que, idealmente, se deben combinar múltiples genes menores de resistencia de planta adulta y de resistencia de plántula para optimizar tanto el nivel de resistencia como su durabilidad en las variedades de trigo por liberar. Aun con esto, se requerirá una evaluación rigurosa del efecto agronómico de las combinaciones de genes de resistencia en el fenotipo y en el potencial de rendimiento.

Conclusiones

Con el análisis de los genotipos en plántula y planta adulta se identificaron materiales susceptibles y resistentes a la raza MBJ/SP/ Puccinia triticina lo que permitió hacer una selección de estos para futuros estudios. Los marcadores moleculares utilizados permitieron identificar a los genes Lr34, Lr46, Lr68 y LrB1 en los genotipos de trigo analizados. De forma general, se observó que, a mayor número de estos genes presentes en los genotipos, los niveles de roya de la hoja fueron menores. La utilidad de los marcadores moleculares asociados a los genes de resistencia identificados permitirá la selección de genotipos de trigo harineros más sobresalientes que se pueden incluir en futuros planes de cruzamiento de los programas de mejoramiento genético.