Caracterización morfológica y molecular de Fusarium incarnatum asociado a la Malformación del Mango (Mangifera indica) en Sinaloa, México

Introducción

El mango (Mangifera indica) es el frutal de mayor importancia económica en las regiones tropicales y subtropicales del mundo. México es uno de los principales productores a nivel mundial, en el 2022 ocupó el quinto lugar en cuanto a superficie y producción, aportando 2,485,545 t (FAO, 2024), mientras que Sinaloa en 2022 aportó 407,831.14 t posicionándose en el segundo lugar (SIAP, 2024). Sin embargo, dicha producción es afectada por enfermedades destructivas como la “enfermedad de la malformación del mango”, “escoba de bruja” o proliferación vegetativa y floral (PVF), reportada por primera vez en India en 1891 (Krishnan et al., 2009), misma que afecta brotes vegetativos y florales; destacando su severidad y control ineficiente, presentándose en la mayoría de las variedades y zonas cultivadas (Ploetz, 2007); las inflorescencias marchitas que permanecen en el árbol provocan el contagio de la enfermedad a yemas sanas (Gamliel-Atinsky et al., 2009).

El cultivo de mango es afectado por 83 enfermedades y trastornos diferentes, en los que destaca 52 enfermedades fúngicas y tres bacterianas, aunado a que presenta nematodos fitoparásitos del árbol y de la fruta que causan pérdidas (Pernezny y Simone, 2000). El género Fusarium descrito por Link (Link, 1809), pertenece a la familia Nectriaceae, el cual engloba más de 100 especies, de las cuales la mayoría son patógenas de plantas. Entre los síntomas que ocasionan está la marchitez, tizones y pudriciones, en diferentes cultivos de importancia económica y ecosistemas naturales (Ma et al., 2013).

En Fusarium, se han descrito varias especies ocasionando enfermedades en mango, F. decemcellulare se reportó como agente causal de la malformación en Venezuela y muerte regresiva en China (Castellano y Guanipa, 2004; Qi et al., 2013), F. proliferatum causando la malformación y mancha foliar en China (Zhan et al., 2010; Omar et al., 2018), la malformación se ha reportado en Pakistán asociada a F. nivale (Khaskheli et al., 2008), en Senegal y España ocasionada por F. tupiense (Lamine et al., 2012; Crespo et al., 2016), en República Dominicana se asoció a F. pseudocircinatum (García-López et al., 2016). En México se informó que los agentes causales son F. subglutinans (Mora, 2000), F. mexicanum (Otero-Colina et al., 2010), F. pseudocircinatum (Freeman et al., 2014), F. neocosmosporiellum y F. proliferatum (Molina-Cárdenas et al., 2021; 2023). Debido a la importancia de la enfermedad, se plantea que más especies de Fusarium pueden causar la malformación por ello, el objetivo del presente estudio fue identificar a nivel morfológico y molecular al agente fitopatógeno asociado a la malformación del mango en Sinaloa, México.

En 2018 se observaron árboles de mango con malformación floral y vegetativa en huertas comerciales y se recolectaron 25 muestras de tejido de árboles con síntomas como hinchazón de yemas, erupción de múltiples brotes terminando en ápice con apariencia de racimo y panícula compactada, en los municipios de Culiacán (6 muestras) localizada a 24º 19’ 53.6’’ LN 107º 21’ 59.2’’ LO, Navolato (3 muestras) 24° 46' 08.6" LN 107° 33' 10.0" LO, El Rosario (10 muestras) 22° 54' 40.9" LN 105° 53' 45.3 "LO y Escuinapa (6 muestras) 22° 53' 52.9 "LN 105° 48' 30.9" LO en Sinaloa. Las muestras fueron etiquetadas y transportadas al laboratorio de Fitoprotección de la Facultad de Agronomía (UAS) para ser analizadas, el aislamiento del patógeno se realizó cortando pequeños trozos de las muestras con síntomas que se desinfestaron superficialmente con hipoclorito de sodio al 2 % durante tres minutos y etanol al 70 % por tres minutos, posteriormente se procedió a enjuagarlos dos veces por tres minutos con agua destilada esterilizada. Los trozos se colocaron en papel absorbente estéril, para retirar la humedad, se sembraron en cajas de Petri con medio de cultivo Papa Dextrosa Agar (PDA) y se incubaron a 25 ºC. Para obtener los cultivos monospóricos se utilizó la metodología propuesta por Hansen y Smith (1932), donde se colocó un trozo del micelio en un tubo eppendorf con 1 mL de agua destilada estéril y mediante diluciones seriadas se eligió una espora la cual se colocó en una nueva caja con medio de cultivo PDA.

Para la caracterización morfológica se siguió la metodología propuesta por Leslie y Summerell (2006). Para ello, los aislados se cultivaron en PDA a 25 ºC en la oscuridad por 10 días, para observar la formación de micelio aéreo y color de la colonia. Posteriormente, se transfirió a medio de cultivo agar hoja de clavel (CLA), bajo las mismas condiciones anteriormente mencionadas, por medio de un microscopio óptico se observaron el largo y ancho de microconidias y macroconidias (n=50), número de septos, forma, disposición de células conidiógenas en monofialides y polifialides, la presencia o ausencia de esporodoquios y clamidosporas. Para la medición de las estructuras fúngicas (n=50) se utilizó un microscopio óptico con cámara acoplada al software DinoCapture versión 2.0.

Para la caracterización molecular se seleccionaron dos aislados monospóricos (95VESIN y 121FRSIN), de un total de ocho aislados que fueron caracterizados por morfología. El micelio de los aislados se colectó raspando la superficie de las colonias crecidas en PDA previamente incubadas durante una semana a 25 ºC. Se procedió a pulverizar 100 mg de micelio fúngico de cada aislamiento en nitrógeno líquido y se extrajo el ADN genómico mediante el método descrito por Ausubel et al. (2003). La calidad y concentración de ADN se estimaron utilizando un espectrofotómetro Thermo Scientific NanoDropT^TM 1000 (Fisher Scientific).

El ADN extraído de los aislados de Fusarium se analizó mediante PCR punto final con los cebadores: EF 1 (D) ATGGGTAAGGA(A/G)GACAAGAC, EF 2

(R)GGA(G/A)GTACCAGT(G/C)ATCATGTT (O´Donell et al., 1998; Geiser et al., 2004). La mezcla de la reacción final fue de 25 μL que contenía 100 ng de ADN molde, una mezcla equimolar de dNTPs y 25 nM MgCl2, 2.1 U de ADN Taq Polimerasa y 40 pmol de cada oligonucleótido (Bioline, TN, EE. UU.).

Los productos amplificados de PCR (ADN del gen TEF-1α) fueron purificados y secuenciados por Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias se utilizaron para buscar similitud y comprobar su identidad al compararse con las secuencias de la base de datos de GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gobierno) utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) y en BLAST en Fusarium-ID. Las especies se identificaron basándose en una identidad de secuencia del 99 al 100 %. Para el análisis filogenético, las secuencias del gen TEF-1α de los aislados se alinearon con secuencias de referencias obtenidas del GenBank y las relaciones filogenéticas entre los cultivos monospóricos de Fusarium se infirieron basándose en la alineación de las secuencias de nucleótidos del gen. El árbol se construyó mediante el método de unión de vecinos basado en distancias determinadas por el método de Jukes y Cantor (Erickson, 2010) utilizando 1,000 réplicas de arranque.

Se evaluó la capacidad de ocho aislados provenientes de los municipios de Culiacán (161VCSIN, 163VCSIN y 166VCSIN), Navolato (170FNSIN), El Rosario (39VRSIN,

121FRSIN y 134VRSIN) y Escuinapa (95VESIN), que fueron caracterizados por morfología como Fusarium incarnatum, para causar la enfermedad de la malformación, mediante inoculaciones artificiales en cinco plantas sanas de mango criollo por aislado, de cuatro meses de edad contenidas en bolsas de polietileno con suelo estéril, mantenidas en condiciones de invernadero durante 12 meses. El inóculo se preparó cultivando los aislados en CLA bajo luz fluorescente blanca fría durante 14 días a 25 ºC para estimular la esporulación (Freeman et al., 1999). Las pruebas de patogenicidad se realizaron durante 2019-2021. Se inocularon las yemas apicales y cinco nudos por planta, inyectando 20 μL de la suspensión de conidios (1 x 10⁶ conidios mL^-1), y se inocularon cinco nudos por planta. Las plantas testigo se inocularon con agua destilada estéril. Los ensayos de patogenicidad se realizaron dos veces. La severidad de la enfermedad se evaluó mediante la escala propuesta por Iqbal et al. (2006) (Cuadro 1) con modificaciones, 0 es una planta asintomática y 5 es una planta con síntomas más severos.

Los aislados se caracterizaron morfológicamente como F. incarnatum (Leslie y Summerell, 2006; Xia et al., 2019) y en medio de cultivo PDA mostraron un micelio algodonoso de coloración blanco a café, con el tiempo se tornaron café oscuro. En medio de cultivo CLA las microconidias (n=50) eran piriformes, de 0 -1 septos, midiendo 7.4-

30.9 x 3.8-8.3 µm. Las macroconidias (n=50) eran relativamente esbeltos con una curva en la célula basal y apical, de 3 a 5 septos, midiendo 41.4-92.7 x 4.2-10.1 µm. Se observaron esporodoquios de color café y clamidosporas intercaladas y solitarias (Figura 1).

Los ocho aislados denominados; 39VRSIN, 95VESIN, 121FRSIN, 134VRSIN, 161VCSIN, 163VCSIN, 166VCSIN y 170FRSIN indujeron síntomas, con un rango en la escala de severidad de la enfermedad de 2 a 4. Se observaron síntomas como hinchazón, múltiples brotes, entrenudos acortados y hojas escamosas, entre las siete y 13 semanas después de la inoculación (Figura 2). De los síntomas se aisló al hongo y fue identificado con las mismas características morfológicas descritas previamente para Fusarium incarnatum, cumpliendo así con los postulados de Koch.

F. incarnatum ha sido reportado previamente por Gai et al. (2016) como agente causal de la podredumbre del tallo del maíz (Zea mays) en China y en India causando tizón y marchitez de la hoja en cacahuate (Arachis hypogaea), observándose los síntomas a los 6 días después de la inoculación (Thirumalaisamy et al., 2018), como también ocasionando pudrición del fruto de moringa (Moringa oleifera) (Ekabote et al., 2023). A su vez se reportó a una especie del complejo FIESC como primer informe causando la pudrición del fruto del melón (Cucumis melo) en Taiwán (Ahmen et al., 2023).

La ausencia de regulaciones sanitarias en el tránsito de material vegetativo de viveros de mango a regiones distintas de un país podría contribuir a diseminar a este patógeno (Zheng y Ploetz, 2002). Además, es un hongo que puede sobrevivir en el suelo ya que forma estructuras de resistencia llamadas clamidosporas, en ausencia del hospedante y cuando tiene una planta huésped y con las condiciones favorables, se puede iniciar la infección en raíces o en partes aéreas de las plantas, favoreciéndose a través del agua o aire (Ma et al., 2013).

Las secuencias de los aislados (95VESIN y 121FRSIN) se depositaron en la base de datos del GenBank con los números de accesión; MK932800 y MK932804, respectivamente. El análisis de las secuencias en las bases de datos del GenBank y Fusarium-ID, mostraron que las secuencias estaban alineadas a especies del complejo Fusarium incarnatum-equiseti (FIESC), en el GenBank los dos aislados presentaron una homología del 99 al 100 % con Fusarium incarnatum y F. pernabucanum, en el Fusarium-ID mostraron una similitud del 99.84 % con las secuencias (MK289625 y MK289588) registradas como Fusarium pernambucanum.

El filograma obtenido con las secuencias en estudio y las otras secuencias registradas en el GenBank se dividió en tres grupos, en el primero las secuencias registradas en el presente estudio marcadas en negrita, donde se observa que formaron un grupo donde se alinearon con secuencias de F. incarnatum registradas de otros países, por ejemplo, de China e India. Los dos grupos restantes representan grupos externos (Figura 3).

Se reporta por primera vez a Fusarium incarnatum causando la malformación en mango, en Sinaloa, México. Por ello es de suma importancia futuras investigaciones para comprender la relación patógeno-huésped, ya que es un nuevo patógeno en un nuevo cultivo y así poder diseñar estrategias de control adecuadas para la enfermedad.