Sustrato degradado de Pleurotus ostreatus como nematicida de Nacobbus aberrans en plantas de chile (Capsicum annuum)

Introducción

El nematodo falso agallador (Nacobbus aberrans) es uno de los 10 principales fitoparásitos de mayor importancia económica por tener un amplio rango de hospedantes (Jones et al., 2013). Los principales cultivos que afecta son: papa (Solanum tuberosum), jitomate (Solanum lycopersicum), remolacha (Beta vulgaris), chile (Capsicum annuum), frijol (Phaseolus vulgaris), pepino (Cucumis sativus) y berenjena (Solanum melongena) (Manzanilla-López et al., 2002). Las pérdidas que genera en producción varían de acuerdo con el hospedante: 35 % en frijol, de 50-90 % en jitomate, 80 % en papa; en el cultivo de chile las estadísticas de pérdidas económicas en México no están registradas (Toledo et al., 1992; Cristóbal-Alejo et al., 2006). El chile es un cultivo fundamental en la agricultura mexicana, no solo por su alto valor comercial, sino también por su impacto en la alimentación y cultura del país. En 2020, México se posicionó como el segundo productor mundial de chiles, con una cosecha de 3,324,260 toneladas, lo que representó un incremento del 2.7 % respecto al año anterior (SADER, 2021). El uso de C. annuum como planta modelo para el estudio de N. aberrans es de gran importancia debido a su susceptibilidad a este fitoparásito y su relevancia económica en México. En diversas zonas productoras, la presencia de este nematodo puede representar una amenaza significativa para los rendimientos, lo que hace imprescindible el desarrollo de estrategias efectivas para su control y manejo.

Una alternativa para el biocontrol de los nematodos es el uso de hongos comestibles (HC) con actividad nematicida. Al respecto, según Li y Zhang (2014), existen 280 especies pertenecientes a 150 géneros que presentan actividad nematicida particularmente contra nematodos de importancia agrícola como Meloidogyne incognita y N. aberrans (Rodríguez-Barrera et al., 2021). La actividad nematicida presente en los HC está relacionada con compuestos como proteasas (aspartil proteasas), ácidos grasos (ácido pentadecanoico, ácido palmítico, β-sitosterol, ácido esteárico y ácido linoleico), y metabolitos secundarios como alcaloides, sesquiterpenoides, y otros compuestos fenólicos (Beltrán-Delgado et al., 2013; Carrillo-Lara et al., 2017; Pineda-Alegría et al., 2020).

En el proceso de producción del HC Pleurotus ostreatus se encuentra el subproducto denominado sustrato degradado (SDPO), término empleado en este trabajo para referirse al subproducto orgánico generado por P. ostreatus (De León-Monzón et al., 2004). La biomasa lignocelulósica formada en el cultivo de HC está compuesta principalmente por lignina (5-35 %), celulosa (9-80 %) y hemicelulosa (10-50 %), y su biodegradabilidad está altamente influenciada por los insumos que lo componen (Aguilar-Marcelino et al., 2024). Independientemente del sustrato, se ha reportado que el SDPO contiene compuestos tóxicos contra nematodos de importancia agrícola. Diversos autores han observado la capacidad predatoria del micelio de los hongos, observando estructuras capaces de inmovilizar nematodos y posteriormente colonizarlos (Luo et al., 2007; Armas-Tizapantzi et al., 2019). Esto se ha observado en nematodos de vida libre y en parásitos de plantas como Heterodera schachtii, depredado por el hongo P. sajor-caju (Palizi et al., 2009).

En otro contexto, se ha observado la infección de los J2 del nematodo agallador Meloidogyne javanica por el micelio del hongo comestible de Pleurotus, adicionalmente los filtrados del micelio de estos, presentaron actividad nematicida y nemostático contra M. javanica (Hahn et al., 2019). Dentro de los compuestos presentes en el SDPO con mayor actividad nematicida se encuentran los ésteres de ácidos grasos asociados al micelio (Chegwin y Nieto, 2013), compuestos fenólicos (Aslam y Saifullah, 2013), toxinas (ácido trans -2- decenodioico) (Abbasi et al., 2014), y enzimas (proteasas) (De Freitas-Soares et al., 2019). Asimismo, se ha observado que el SDPO tiene propiedades antagónicas contra hongos fitopatógenos, tal es el caso de la efectividad supresiva del SDPO sobre la inhibición del crecimiento de Fusarium oxysporum (Yusidah y Istifadah, 2018). De igual manera, el extracto acuoso del sustrato degradado de Lyophyllum decastes fue efectivo en el control de la antracnosis inducida por Colletotrichum orbiculare en el cultivo de pepino (Parada et al., 2011). Por otro lado, se estimó la activación de mecanismos de defensa en plantas de chile infectadas con Phytophthora capsici cuando se confrontaron con extractos acuosos del hongo Lentinula edodes (Kang et al., 2017). Por lo que, la presente investigación tiene como objetivo determinar el efecto in vitro del extracto hidroalcohólico SDPO contra larvas de N. aberrans, y evaluar la efectividad in situ en plantas de chile (C. annuum) como alternativa para el biocontrol del nematodo falso agallador N. aberrans.

La cepa del hongo P. ostreatus (HEMIM-50), fue proporcionada por el Centro de Investigaciones Biológicas de la Universidad Autónoma del Estado de Morelos (CIB- UAEM). Se obtuvo el inóculo en semilla de trigo pasteurizada e inoculada con fragmentos de micelio, se creció por 21 días a 27 °C, un fotoperíodo de 12:12 h de luz:oscuridad, 80- 90 % de humedad relativa y ventilación forzada. La paja de trigo (Triticum aestivum) en donde creció el hongo se pasteurizó, inicialmente el agua (133 L) se calentó (75-80 °C), se le agregó 1 kg de cal y 500 g de yeso hasta disolverlos, se sumergió la paja por una hora. Una vez realizada la pasteurización, se drenó el exceso de humedad del substrato. La paja pasteurizada e hidratada (70%) se colocó en bolsas de plástico junto con la semilla, donde se intercaló capas de substrato y semilla invadida con micelio y se incubó (25 °C) por 20 días en oscuridad (Sánchez, 2010).

Después de obtener los cuerpos fructíferos, el SDPO se deshidrató en obscuridad suministrando corrientes de aire hasta obtener un peso constante, el SDPO se almacenó en bolsas estériles en refrigeración (4 °C) hasta su uso, para evitar contaminación de microorganismos que afecten las propiedades fisicoquímicas (Postemsky y López-Castro, 2016). Para obtener los extractos hidroalcohólicos (70 %), se añadió alcohol (1:3 g/v) al SDPO y se dejó macerar durante 24 h a 25 °C. Posteriormente se filtró, se concentró utilizando un rotaevaporador y se liofilizó para su secado, finalmente se almacenó a 4 °C hasta su uso (Pineda-Alegría et al., 2017).

El inóculo de N. aberrans se obtuvo de una población pura con raíces agalladas de jitomate (Solanum lycopersicum), la cuales se recolectaron en el Colegio de Postgraduados, Campus Montecillo, Estado de México, México. Se obtuvieron huevos utilizando el método descrito por Babaali et al. (2107). Los huevos frescos se incubaron a 27 °C por ocho días en placas de Petri con agua destilada estéril, hasta la eclosión y obtención de juveniles del segundo estadio (J2) (Vázquez-Sánchez et al., 2018).

Las semillas de chile var. California Wonder susceptible a N. aberrans se desinfectaron con hipoclorito de sodio al 1% por 1 min, se enjuagaron, se secaron y colocaron en placas de Petri sobre toallas de papel humedecidas con agua estéril y se germinaron a 27 °C. Cuando las plántulas tuvieron 60 días de edad en las placas de Petri, se trasplantaron en macetas de 1 kg que contenían los tratamientos a evaluar in situ y se dejó transcurrir 30 días antes de establecer el experimento. Se mantuvieron en condiciones de invernadero con riego diario hasta que desarrollaron tres pares de hojas verdaderas (siete semanas de edad). A los 30 días después del trasplante cada plántula de chile se inoculó con 2 mL de agua conteniendo 2000 J2 en la base del tallo con una jeringa hipodérmica y se mantuvo un riego moderado para garantizar la humedad (Chavarro- Carrero et al., 2017).

Para la evaluación in situ se utilizaron macetas de 1 L de capacidad con 10 repeticiones con cada uno de los siguientes tratamientos: T1= control (Peat moss), T2= Nematicida (Peat moss + Fluopiram) y T3= SDPO (Peat moss 80% + SDPO 20%). Las variables evaluadas fueron: número de agallas, masas de huevos y huevos por gramo de raíz a los 45 días después de la inoculación (ddi). El número de agallas se obtuvo con la ayuda de una lupa. Para tener el número de masas de huevos, los huevos se sumergieron en una solución de Floxina B (0.15 g L^-1 de agua) por 20 min, para que las masas de huevos se tiñeran de rojo y se facilitara el conteo, después se retiró el colorante y con ayuda de una lupa se realizó el conteo. Para el determinar el número de huevos por gramo de raíz se siguió el método descrito por Vrain (1977). El conteo consistió en colocar alícuotas de 10 µL con 10 repeticiones por muestra y observarlas en el microscopio, posteriormente se dividió el número total de masas de huevos entre el peso de las raíces en gramos. Los resultados se expresaron en número de huevos por gramo de raíz (número de huevos g raíz^-1). El ensayo se realizó bajo un diseño completamente al azar con siete repeticiones por tratamiento y un total de 21 unidades experimentales.

Para las pruebas in vitro se utilizaron placas de microtitulación de 96 pocillos, donde se colocaron seis diluciones del extracto hidroalcohólico de SDPO en concentraciones seriadas de 0.6, 1.2, 2.5, 5 y 20 mg mL^-1 en 100 µL finales con 50 nematodos (J2) de N. aberrans. Se incluyó un control negativo PBS (Tampón Fosfato Salino, pH 7.4) y un control positivo nematicida comercial (Verango Prime®) (50 mg mL^-1 Fluopiram). El bioensayo se realizó por duplicado bajo un arreglo complemente al azar con cuatro repeticiones por cada tratamiento. Las placas se cubrieron con papel aluminio y se incubaron a 27 °C. Finalmente, tras 72 h post confrontación se realizaron las lecturas de mortalidad de acuerdo al método descrito por Pineda-Alegría et al. (2017).

Análisis estadístico. Todos los datos experimentales fueron analizados bajo un diseño completamente al azar. En las pruebas in vitro se realizó un ANOVA, seguido de una comparación de medias con la prueba de Tukey (p<0.05), ajustado con Schiller-Orelli. Para el ensayo in situ se homogenizó las varianzas, los datos se transformaron por raíz cuadrada (x+1), y fueron analizados con el procedimiento del Modelo Lineal General (GLM) y la prueba Mínima Diferencia Significativa (LSD) de Fisher para comparar las medias de cada tratamiento. Todos los análisis se realizaron en el programa estadístico Statistical Analysis System SAS 9.0.

El mayor porcentaje de mortalidad de J2, se obtuvo con el T6 (20 mg mL^-1) con un 98 % de mortalidad y no tuvo diferencia significativa respecto al control positivo Fluopiram (99.3 %), seguido del T5 que provocó un 88.3 % de mortalidad. En las concentraciones de 0.6, 1.2 y 2.5 mg mL^-1 presentaron bajo porcentaje de mortalidad y no hubo diferencias significativas entre sus medias y el control con PBS (Cuadro 1).

En las evaluaciones in vitro de mortalidad realizadas en el presente estudio se logró disminuir la población de N. aberrans hasta un 98 % con el extracto del SDPO con 20 mg mL^-1, lo que sugirió que la mortalidad, está relacionada con el incremento de concentración. Este efecto podría atribuirse a la presencia de metabolitos secundarios en el extracto, los cuales han sido ampliamente notificados por su actividad nematicida. Metabolitos secundarios como: 1) fenoles, 2) flavonoides, 3) saponinas y 4) terpenoides podrían estar involucrados en la despolarización de la membrana celular de los nematodos parásitos, afectando su homeostasis y causando su muerte. Por ejemplo, se ha notificado que los fenoles pueden inducir daño en las membranas celulares y alterar la actividad enzimática (peroxidasas, proteasas de cisteína o quitinasas) esenciales para la supervivencia de los nematodos (Chitwood, 2002). Los flavonoides han demostrado ser tóxicos para diversos nematodos al interferir con procesos bioquímicos fundamentales, como la inhibición de enzimas antioxidantes, lo que provoca estrés oxidativo (especies reactivas de oxígeno) (Chin et al., 2018). Las saponinas han sido identificadas como disruptores de la permeabilidad celular, promoviendo la lisis de membranas y alterando el metabolismo energético de los nematodos (Francis et al., 2002). Por su parte, los terpenoides han mostrado actividad nematicida a través de la inhibición de la motilidad e inducción de parálisis, probablemente por su interacción con receptores neuronales y canales iónicos en la membrana celular (Ntalli y Caboni, 2012). Además, los resultados in vitro del presente estudio fueron superiores a lo reportados por Hahn et al. (2019), con extractos acuosos de P. djamor y P. erygii donde lograron una mortalidad del 78 y 90 % en J2 de M. incognita. También, se ha notificado una CL50 de 2.7 mg mL^-1 (2.64-2.82) cuando se confrontó larvas J2 de N. aberrans contra extractos hidroalcohólicos de un sustrato degradado por P. ostreatus conformado por pulpa de café (Coffea canephora), pasto pangola (Digitaria eriantha) y olote de maíz (Zea mays) (Cruz-Arévalo et al., 2024).

En la evaluación in situ del presente trabajo con el SDPO contra N. aberrans, se encontró que el tratamiento T3 de Peat moss 80 % + SDPO 20 % (v/v) es satisfactorio, ya que el número de agallas que se formaron en el sistema radicular de las plantas de chile a los 45 ddi, se redujo significativamente en 82 %, las masas de huevos disminuyó un 99 y un 98 % el número de huevos, con respecto al tratamiento T1 (Peat moss), y no tuvo diferencias significativas en comparación con el tratamiento T2 (Peat moss + Fluopiram) (Cuadro 2). Estos resultados son similares utilizando diferentes porcentajes de SDPO (30, 50 y 70 %), para el control de Meloidogyne spp. en macetas en condiciones de invernadero donde se logró reducir de forma significativa hasta un 70 % la población de nematodos (Abbasi et al., 2014).

Con la utilización de SDPO cultivado en salvado de trigo y arroz al aplicar 1200 g m^{2 -1}, disminuyeron de 86.2 a 80.2 % el número de agallas y masas de huevos de M. incognita (Mostafa et al., 2019). Otros reportes han evidenciado que la actividad nematicida del SDPO contra N. aberrans logra una reducción significativa al aplicar una dosis de 10, 20 y 30 g mL^-1 en macetas en invernadero con 1 kg de suelo franco arenoso esterilizado (Aslam y Saifullah, 2013). Adicionalmente, en evaluaciones in vitro reportaron que con una concentración de 10.7 μg mg^-1 de SDPO fue efectiva para reducir la eclosión de huevos y eliminar juveniles de nematodos agalladores.

Por otro lado, se han realizado investigaciones sobre el uso de diferentes sustratos agrícolas para el cultivo de P. ostreatus, lo que podría influir en la actividad nematicida del sustrato degradado. Por ejemplo, un estudio evaluó la capacidad productiva de P. ostreatus utilizando alfalfa (Medicago sativa) deshidratada como suplemento en diferentes sustratos agrícolas, encontrando que la suplementación con alfalfa incrementó la eficiencia biológica y la tasa de biodegradación de los sustratos (Romero et al., 2018). Otro estudio evaluó la producción de P. ostreatus en diferentes sustratos agroresiduales, como paja de cebada (Hordeum vulgare), hoja de plátano (Musa paradisiaca) y forraje de maíz (Zea mays), y encontró que la mezcla de estos sustratos puede influir en la producción del hongo comestible y, potencialmente, en las propiedades del sustrato degradado (Vázquez-Vázquez et al., 2020). Aunque estos estudios no abordan un estudio sobre la actividad nematicida del sustrato degradado de P. ostreatus contra N. aberrans, es importante la búsqueda de insumos naturales efectivos con el fin de reducir el uso de nematicidas comerciales. Este paso es vital para una producción agrícola sostenible; sin embargo, es esencial conocer cómo actúan los metabolitos activos presentes y analizar su eficacia en condiciones reales de campo.

Los resultados de la presente investigación permiten concluir que el SDPO posee actividad nematicida del 98 % de mortalidad in vitro contra juveniles de segundo estadio

N. aberrans. Además, en el ensayo in situ el mejor tratamiento fue la combinación de Peat moss 80 % + SDPO 20 %, ya que se logró disminuir un 82 % el número de agallas y un 98 % el número de masas de huevos de N. aberrans. Cabe resaltar que la paja de trigo donde el hongo fue crecido es un insumo económico y el residuo puede ser aprovechado como fuente de metabolitos secundarios para el control de nematodos agalladores, por lo que los resultados respaldan el potencial del SDPO como una herramienta sustentable y sostenible para el manejo de N. aberrans que afectan el cultivo de chile en México, ofreciendo alternativas naturales de control.