Caracterización e identificación de Burkholderia glumae en semillas de variedades de arroz (Oryza sativa) cultivadas en México

Introducción

El arroz (Oryza sativa) es uno de los cultivos de mayor importancia a nivel mundial, debido a que es un alimento básico para más de 3.5 billones de personas (Faizal-Azizi y Lau, 2022). Los principales países productores de este cereal son China Continental, India, Indonesia, Vietnam y Tailandia (FAOSTAT, 2023). En México, el arroz se encuentra entre los cuatro principales cultivos básicos en la dieta de la población. A nivel nacional, se cultivan aproximadamente 40 mil ha con más de 17 variedades de arroz en diversas condiciones agroecológicas, especialmente en los estados de Campeche, Jalisco, Morelos, Nayarit y Tamaulipas, con una producción de 246 mil t, fortaleciendo la economía agroindustrial del país (SIAP, 2023).

A nivel mundial, el cultivo de arroz es afectado por diferentes patógenos; sin embargo, Acidovorax avenae subsp. avenae, Burkholderia glumae y Xanthomonas oryzae pv. oryzae se ubican entre los principales patógenos bacterianos que se transmiten por semilla (Kang et al., 2016). No obstante, B. glumae, agente causal del tizón bacteriano de la panícula (TBP), se destaca por su distribución mundial e importancia económica (Cui et al., 2016).

B. glumae se ha reportado en más de 18 países como un patógeno altamente destructivo en el cultivo de arroz (Zhou, 2019). Durante la última década, el TBP se ha considerado una enfermedad emergente que ha aumentado su incidencia y severidad en países que cultivan arroz, debido al cambio climático, provocando pérdidas de hasta

75 % en el rendimiento y calidad del grano en climas tropicales y subtropicales, especialmente en regiones con alta temperatura y humedad relativa (Abhishekh-Gowda et al., 2022; Mizobuchi et al., 2018). En el continente americano, la presencia de B. glumae se ha reportado en Colombia, Estados Unidos de América, Panamá, Venezuela, Nicaragua, Ecuador, Costa Rica, República Dominicana y Puerto Rico (CABI, 2021).

B. glumae puede sobrevivir en semillas, proliferar en tejidos vegetales, colonizar diferentes microambientes en la planta y causar severas epidemias en el cultivo de arroz, debido a su alta eficiencia de transmisión y diseminación por semillas (Ortega y Rojas, 2021). En consecuencia, la enfermedad de TBP inicia a partir de la semilla infectada, como inoculo primario. Posteriormente, el patógeno se disemina por salpique del agua de riego y por contacto físico entre panículas sanas y enfermas (Ham et al., 2011; Hasegawa, 2012; Zhou, 2019). A nivel mundial, los síntomas del TBP que se reportan con mayor frecuencia son manchado de glumas, ausencia o escaso desarrollo de grano, pudrición de semillas, desarrollo anormal de raíces y pudrición de plántulas (Sayler et al., 2006), así como tizón de plántulas y panículas (Faizal-Azizi y Lau, 2022; Zhou-qi et al., 2016).

Investigadores del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), campo experimental Zacatepec, Morelos, son líderes nacionales en el mejoramiento genético de arroz contra diversos agentes patógenos bióticos y abióticos. Desde el 2016, en experimentos de campo en el INIFAP, Zacatepec, Morelos, se han observado semillas de diferentes variedades de arroz con manchas en las glumas. En esta investigación, se asume que estos síntomas son causados por Burkholderia glumae, por la similitud con las manchas en glumas de semilla de arroz reportados para este patógeno como agente causal de la enfermedad del TBP (Ramachandran et al., 2021).

El objetivo de esta investigación fue caracterizar e identificar el agente causal de los síntomas de manchado de glumas de variedades de arroz cultivadas en México. La identificación del agente causal de estos síntomas en glumas en semillas de arroz es fundamental para desarrollar futuras estrategias de prevención, manejo y mejoramiento genético en el cultivo de arroz en México.

Materiales y métodos

Material vegetal. En 2022, se analizaron 37 muestras de semillas con diferente porcentaje de daño de manchado y necrosis de glumas de 11 variedades de arroz cultivadas en México (Cuadro 1, Figura 1), proporcionadas por el INIFAP-Campo experimental Zacatepec, Morelos.

Aislamiento de bacterias. De cada muestra, se desinfestó 1 g de semilla con hipoclorito de sodio (0.5 % v/v) por 5 min y se enjuagó tres veces con agua destilada estéril. Las semillas se colocaron en matraces con 5 mL de amortiguador PBS (Buffer salino de Fosfato) (pH 7.2) y se mantuvieron en agitación a 125 rpm (ORBIT 1900, Labnet) durante 1 h. Posteriormente, se maceraron en un mortero estéril con 5 mL de amortiguador PBS y se realizaron diluciones seriadas hasta 10^-2. De cada dilución, se sembraron 20 µL con un asa Digralsky en placas Petri con medio de cultivo sacarosa-fosfato-glutamato (S-PG) semi-selectivo para B. glumae (Quesada-González y García-Santamaría, 2014). Las placas se incubaron a 30 °C por 48 h. Del crecimiento bacteriano, se transfirieron colonias individuales con fenotipo similar a B. glumae (colonias circulares, convexas, con márgenes lisos y centro rojo-púrpura) (Abhishekh-Gowda et al., 2022), a los medios de cultivo B de King y Wilbrinks (Koike, 1965) y se incubaron a 30 °C por 48 h. Las colonias con fenotipo similar a B. glumae se preservaron en cultivo criogénico (-80 °C) en caldo nutritivo y glicerol (40 %) para estudios posteriores.

Caracterización fisiológica y bioquímica. Los aislados bacterianos se caracterizaron fisiológica y bioquímicamente mediante API 20E (Biomerieux, Durhan, NC, U.S.A.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Así mismo, se evaluó su actividad pectinolítica en papa (Solanum tuberosum) y la hipersensibilidad (RH) en tabaco (Nicotiana tabacum cv. xanthi) (Goszczynska et al., 2000).

Identificación molecular. El ADN genómico de los aislados bacterianos se obtuvo por el método CTAB 2 % (Doyle y Doyle, 1990) a partir de cultivos puros en medio B de King con 48 h de crecimiento a 28 °C, con modificaciones: Durante el proceso de lisis, se agregaron 300 µL de CTAB al 2% (1.4 M NaCl, 0.02 M EDTA, 0.1 M Tris-HCl pH 8, y 2 g de CTAB por 100 mL de buffer) y 3 µL de Beta Mercaptoetanol al 10 %, y se incubó a 55 °C por 30 min. En la precipitación se colectó 200 µL de la fase acuosa y se agregaron 300 µL de isopropanol (100%) a 4 °C y 30 µL de acetato de amonio (7.5 M) y se mezcló cuidadosamente por inversión. La concentración y pureza de las muestras de ADN se analizaron por espectrofotometría de luz UV a 260 nm con un NanoDrop^TM 2000 (Thermo Fisher Scientific). La integridad se evaluó por electroforesis en gel de agarosa (Invitrogen^TM) al 1 % a 70V por 90 min. La identificación molecular se realizó mediante PCR punto final con 100 ng μL^-1 de ADN de cada aislado bacteriano utilizando iniciadores universales (8F-1492R) y específicos (Bglu3F-BgluR, OgF-OgR) para B. glumae (Cuadro 2). Se utilizó el kit PCR GOTAQ® Flexi DNA Polymerase (Ref. M8295, Promega) en un termociclador C1000 Touch TM Thermal Cycler (Eppendorf).

Las condiciones de PCR para los iniciadores 8F-1492R fueron desnaturalización inicial de 94 °C por 5 min, seguido de 35 ciclos de 94 °C por 60 s, 57 °C por 45 s, 72 °C por 60 s y una extensión final de 72 °C por 8 min. Para los iniciadores específicos Bglu3F- Bglu3R, las condiciones de PCR fueron desnaturalización inicial de 95 °C por 2 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C por 30 s, 54 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y una extensión final de 72 °C por 7 min. Para los iniciadores OgF-OgR, desnaturalización inicial de 95

°C por 2 min, seguido de 35 ciclos de 95 °C por 20 s, 63 °C por 30 s, 72 °C por 30 s y una extensión de 72 °C por 7 min.

Los productos amplificados se detectaron en un gel de agarosa de ácido tris-borato- etileno-diaminotetraacético (EDTA) al 1.5 %, los cuales se purificaron y secuenciaron bidireccionalmente con los tres pares de iniciadores en la empresa Macrogen Inc. (Seúl, Corea del Sur). Las secuencias remitidas se analizaron y se editaron con el programa BioEdit para generar las secuencias consenso de cada cepa. Las secuencias consenso se compararon con las secuencias nucleotídicas de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) a través del programa BLASTn 2.2 (Basic Local Alignment Search Tool). Se determinó el polimorfismo de las cepas en la región 16S rRNA por alineación múltiple de las secuencias de México y las disponibles en el NCBI con el programa CLUSTAL W, implementado en el programa MEGA 11 (Tamura et al., 2021). Con base en las secuencias 16S rRNA de las 11 cepas, se generó un árbol filogenético analizado con el método de Máxima verosimilitud (ML) con 500 repeticiones de Bootstrap. Los árboles se generaron utilizando la secuencia de una especie del género Burkholderia como grupo externo.

Patogenicidad en semilla de arroz. Se utilizó un cultivo puro de la cepa CPM01 de B. glumae, identificada en este estudio, con 48 h de crecimiento en B de King. Las pruebas de patogenicidad se realizaron en semillas de la variedad Milagro Filipino sin síntomas de manchado de glumas. La inoculación se realizó de acuerdo con los protocolos descritos por Li et al. (2016) y Ura et al. (2006) con algunas modificaciones. Quince semillas se desinfestaron con etanol al 70 % (v/v), seguido de hipoclorito de sodio al 0.5 % (v/v) por 5 min y tres lavados con agua destilada estéril. Posteriormente, las semillas se inocularon por inmersión en una suspensión bacteriana con 3.5 x 10⁸ UFC mL^-1 durante 1 h y se colocaron en cajas germinadoras (BOX LARGE, THOMAS SCIENTIFIC, USA). Las cajas se mantuvieron en condiciones de laboratorio a una temperatura constante de 30 °C y humedad relativa >70 %. A los 15 días después de la inoculación (ddi), se registraron síntomas en la semilla, raíz y tallo de plántulas. El ensayo se realizó en un diseño completamente al azar con tres repeticiones por tratamiento. El tratamiento 1 consistió de semillas inoculadas con la cepa CPM01 de B. glumae y el tratamiento 2 de semillas no inoculadas (inmersión de semillas en agua destilada estéril) (testigo).

Patogenicidad en plántulas de arroz. Las pruebas de patogenicidad se realizaron en plántulas sanas de las variedades Milagro Filipino e INIFLAR-R, las cuales se cultivan extensivamente en México (SIAP, 2023). Las plántulas se obtuvieron a partir de semillas sanas y desinfestadas como se describió previamente. Las semillas se sembraron en vasos de unicel (1 kg) con tierra estéril (NUTRIGARDEN). La inoculación se llevó a cabo cuando las plántulas desarrollaron la cuarta hoja (Flórez-Zapata y Uribe-Vélez, 2011). Con una jeringa estéril se hizo una herida en el tallo de las plántulas y se inocularon por aspersión de 3 mL de una suspensión bacteriana con 3.5 x 10⁸ UFC mL^-1 de B. glumae (cepa CPM01). Las plántulas se mantuvieron en condiciones de invernadero a 28-30 °C, con humedad relativa >70 %. A los 15 ddi, se registraron síntomas en tallo. El ensayo se realizó en un diseño completamente al azar con tres repeticiones por tratamiento. El tratamiento 1 consistió de plántulas de Milagro Filipino inoculadas con la cepa CPM01 de B. glumae; el tratamiento 2, de plántulas de INIFLAR-R inoculadas con la cepa CPM01 de B. glumae; y los tratamientos 3 y 4 de plántulas de Milagro Filipino e INIFLAR-R no inoculadas (herida en tallo y aspersión con 3 mL de agua destilada estéril) (testigo). De los tejidos (semilla y tallo) en donde se desarrollaron los síntomas, se reaisló la bacteria inoculada en medio de cultivo B de King y se identificó por PCR con los iniciadores específicos (Bglu3 y Og) para B. glumae.

Resultados

Aislamiento de B. glumae. En nueve (24.3 %) de las 37 muestras de semillas de arroz que se analizaron, se aislaron 11 colonias bacterianas. En el medio sacarosa-fosfato- glutamato (S-PG), las colonias presentaron crecimiento lento, forma circular convexa, con márgenes lisos y centro rojo-púrpura. Estas características fenotípicas se correlacionan con lo que se ha reportado en este mismo medio de cultivo para colonias de B. glumae (Ura et al., 2006; Quesada-González y García-Santamaría, 2014). En los medios de cultivo B de King y Wilbrinks, las bacterias formaron colonias amarillas, circulares elevadas, mucoides y con márgenes lisos (Figura 2). En los tres medios se observó una pigmentación amarilla difusible alrededor de las colonias bacterianas.

De las 11 variedades de arroz analizadas, las cepas bacterianas con fenotipo similar a

B. glumae se aislaron de siete (63.6 %) variedades: GOLFO FL-16, INIFLAR R, INIFLAR RT, IRGA, Milagro Filipino, Morelos A-98 y PACÍFICO FL-15. No se aislaron cepas con este fenotipo de cuatro (36.3 %) variedades: Azteca, Azteca 84, Pacífico B1 y Sauta (Cuadro 3).

Caracterización fisiológica y bioquímica. Las 11 cepas fueron Gram negativas, causaron pudrición blanda en papa e indujeron RH en tabaco. Los resultados de la caracterización mediante API 20E distinguieron dos grupos en función del perfil metabólico. El grupo 1 diferenció las cepas (n= 8) aisladas de las variedades GOLFO FL- 16 (CPM04), INIFLAR R (CPM01), INIFLAR-RT (CPM02 y CPM03), Milagro Filipino (CPN01), Morelos A-98 (CPN02) y PACÍFICO FL-15 (CPM05 y CPM06). El grupo 2 diferenció las cepas (n= 3) aisladas de las variedades IRGA (CPJ01) y Milagro Filipino (CPN03 y CPJ02) (Cuadros 3 y 4).

Identificación molecular de B. glumae. A partir del ADN de las 11 cepas bacterianas aisladas, se amplificaron fragmentos de 1500, 402 y 174 pb con los iniciadores universales 8F-1492R, y los iniciadores específicos para B. glumae Bglu3F-Bglu3R y OgF-OgR, respectivamente (Figura 3).

El análisis bioinformático de los fragmentos de los genes 16S rRNA, proteína putativa y del espacio intergénico 16S-23S rRNA de las 11 cepas indicaron una identidad con valor mayor entre 99-100 % con la secuencia CPO23203.1. de B. glumae reportada en el banco de genes del NCBI (Cuadro 5, Figura 4), que corresponde a la secuencia completa del genoma de la cepa 336 gr-1 de B. glumae, aislada de O. sativa en Luisiana, Estados Unidos de América.

Las secuencias de nucleótidos 16S rRNA de las 11 cepas de B. glumae se registraron en el GenBank del NCBI con los números de acceso: CPM01 (PV435843), CPM02 (PV435844), CPM03 (PV435845), CPM04 (PV435846), CPM05 (PV435847), CPM06 (PV435848), CPN01 (PV435849), CPN02 (PV435850), CPN03 (PV435851), CPJ01 (PV435852), CPJ02 (PV435853).

Patogenicidad de B. glumae en semilla y plántulas de arroz. A los 15 ddi, B. glumae CPM01 causó necrosis y pudrición en 100 % de semillas, raíces y tallo de plántulas de la variedad Milagro Filipino. Asimismo, la bacteria inoculada en los tallos de las plántulas de las variedades Milagro Filipino e INIFLAR-R, causó necrosis y pudrición de tallo, así como el desarrollo anormal de raíces y disminución del crecimiento de las plántulas. En las semillas y plántulas del tratamiento testigo no se observaron síntomas (Figura 5).

Las bacterias inoculadas en semillas y plántulas se reaislaron e identificaron por PCR como B. glumae con los iniciadores específicos Bglu3 y Og descritos previamente confirmando la patogenicidad de la bacteria.

Discusión

El arroz es un cultivo básico para más del 50 % de la población mundial. En esta investigación, se aisló e identificó a B. glumae en semillas de arroz con síntomas de manchado de glumas. De 37 muestras de semillas analizadas, en nueve de ellas (24.3%) se aislaron colonias bacterianas. Las bacterias desarrollaron colonias redondas, convexas, lisas, de color amarillo y centro rojo-púrpura en el medio semiselectivo S-PG, lo que coincide con la morfología descrita para B. glumae en otras investigaciones (Quesada- González y García-Santamaría, 2014; Ramachandran et al., 2021; Tsushima et al., 1986). Así mismo, todas las colonias produjeron un pigmento amarillo difusible en los medios de cultivo B de King y Wilbrinks. Dicho pigmento, conocido como toxoflavina, es una toxina que se considera como un factor de virulencia significativo para la patogenicidad de B. glumae en plantas de arroz (Gil et al., 2022; Maurya et al., 2023).

La identificación de B. glumae se confirmó por PCR con iniciadores universales y específicos. Con base en las secuencias parciales de los genes 16S rRNA, proteína putativa y espacio intergénico 16S-23S rRNA, las 11 cepas aisladas mostraron 100 % de cobertura e identidad con la cepa CP023203.1 de B. glumae depositada en el NCBI. El análisis de secuencias específicas para esta bacteria, como la del gen de proteína putativa (Bglu3), posibilita la identificación precisa de B. glumae y su discriminación entre poblaciones de B. gladioli, las cuales exhiben una elevada similitud fenotípica con las colonias de B. glumae, así como en el mecanismo de biosíntesis de toxoflavina, causando síntomas idénticos a los de B. glumae en semillas y panículas de arroz (Lee et al., 2018; Nandakumar et al., 2009). Asimismo, el análisis de la secuencia del espacio intergénico 16S-23S ARNr (Og) permite separar poblaciones de B. glumae de otros patógenos transmitidos por semillas de arroz como Xanthomonas oryzae pv. oryzae y Acidovorax avenae subsp. avenae (Kang et al., 2016). Burkholderia glumae es un patógeno que se transmite por semilla (Cui et al., 2016; Chompa et al., 2022) y se ha evidenciado que la infección de las semillas de arroz es la principal fuente de diseminación de la bacteria dentro de un país (Abhishekh-Gowda et al., 2022). Se estima que la presencia de B. glumae puede causar pérdidas hasta de 75 % en el rendimiento y calidad del grano, dependiendo de la variedad de arroz en regiones con alta temperatura y humedad relativa (Fory et al., 2014; Shew et al., 2019), como es el caso de las regiones donde se cultiva arroz en México.

En esta investigación, B. glumae se aisló de semillas de siete (63.6 %) variedades de arroz: GOLFO FL-16, INIFLAR-R, INIFLAR-RT, IRGA, Milagro Filipino, Morelos A- 98 y PACÍFICO FL-15. La bacteria se aisló con mayor frecuencia (43 %) de las semillas de la variedad Milagro Filipino, lo que resulta de gran relevancia, ya que esta variedad actualmente registra el 86.8 % de la superficie sembrada en México y se cultiva en ocho de los 12 estados productores de arroz, seguida de la variedad tipo Morelos, con 7.6 % de la superficie total cultivada a nivel nacional (SIAP, 2023).

Hasta ahora, los métodos de control químico, biológico y prácticas culturales no han sido eficientes para el óptimo manejo del TBP (Mizobuchi et al., 2018; Ortega y Rojas, 2021). La resistencia genética de las plantas se considera una de las principales estrategias de control de las enfermedades bacterianas; sin embargo, a nivel mundial, no se han identificado variedades ni híbridos de arroz con resistencia completa a B. glumae. Se han evaluado diversas variedades con el fin de identificar materiales con algún grado de tolerancia o resistencia a la bacteria; pero las variedades cultivadas han mostrado altos niveles de susceptibilidad y niveles moderados de resistencia (Mizobuchi et al., 2018; Shew et al., 2019). No obstante, se consigna que la resistencia a B. glumae en el cultivo de arroz es cuantitativa (asociada a múltiples genes), por lo que se ha sugerido el mapeo de Quantitative Trait Locus (locus de rasgos cuantitativos) (QTL) en las variedades de arroz con estos niveles de resistencia (Pilet-Nayel et al., 2017).

La inoculación de la cepa CPM01 de B. glumae, identificada en este estudio, confirmó la patogenicidad de la bacteria en semillas y plántulas de arroz de las variedades Milagro Filipino e INIFLAR- R, ambas cultivadas extensivamente en México. Se observó una mayor severidad en semillas, raíces y tallos de la variedad Milagro Filipino, lo que sugiere que podrían existir diferentes respuestas de susceptibilidad a la infección de B. glumae en plántulas de las variedades de arroz cultivadas en México.

Hasta la fecha, no existe algún reporte de B. glumae causando la enfermedad del TBP en el cultivo de arroz en México. Sin embrago, en este estudio se evidencia la presencia de B. glumae en semillas con síntomas de manchado de glumas en siete de las 11 variedades de arroz que se cultivan en México; entre ellas, la variedad Milagro Filipino, la cual registra el 86.8 % de la superficie nacional cultivada (SIAP, 2023). Por lo anterior, es necesario profundizar en el conocimiento acerca del origen y vía de ingreso al país, así como la variabilidad genética y virulencia de las poblaciones de B. glumae identificadas en este estudio. En países altamente productores de arroz como Tailandia, Malasia e India, el conocimiento sobre la variabilidad genética y virulencia de B. glumae ha sido importante para el desarrollo de estrategias de manejo del TBP (Jungkhun et al., 2021; Kumar et al., 2023; Ramachandran et al., 2021; Sreenayana et al., 2024).

En 2016, se evaluaron materiales genéticos de arroz en condiciones del trópico seco y húmedo de México. De esta evaluación, se seleccionaron las variedades INIFLAR- RT, INIFLAR-R, Pacífico FL-15 y Golfo FL-16 al mostrar alto potencial de rendimiento, buena calidad industrial del grano y moderada resistencia a Magnaporthe oryzae (sinónimo de Pyricularia oryzae), al rice hoja blanca virus (RHBV) y a Bipolaris oryzae, agentes causales de las enfermedades “quema del arroz”, “hoja blanca del arroz” y “mancha marrón del arroz”, respectivamente (INIFAP-Fondo Sectorial SAGARPA- CONACyT, 2016); no obstante, en esta evaluación no se consideró a B. glumae.

La incorporación de la resistencia a B. glumae en las variedades de arroz requiere de una evaluación minuciosa de la respuesta de los materiales genéticos disponibles contra el patógeno, con el fin de identificar aquellos con mayor resistencia (Zhou, 2019). Debido a la relevancia que tiene B. glumae en el cultivo de arroz a nivel global, en México es fundamental evaluar el nivel de resistencia contra B. glumae de las variedades de arroz cultivadas en la actualidad, ya que se desconoce el grado de susceptibilidad a este patógeno bajo las condiciones ambientales que prevalecen en las áreas en las que se cultiva arroz. En consecuencia, los resultados de esta investigación aportan información relevante para el cultivo de arroz en México, ya que la detección temprana y precisa de

B. glumae en semilla se considera un prerrequisito fundamental para el desarrollo de estudios epidemiológicos, limitar su diseminación, así como para la implementación oportuna de estrategias de contención, prevención y mejoramiento genético de variedades de arroz con resistencia a este patógeno (Abhishekh-Gowda et al., 2022; Faizal-Azzizi y Lau, 2022; Kumar et al., 2023).

Conclusiones

Burkholderia glumae es el agente causal del manchado de glumas en semillas de arroz, se detectó en siete de las once variedades de arroz que se cultivan en México (GOLFO FL- 16, INIFLAR-R, INIFLAR-RT, IRGA, Milagro Filipino, Morelos A-98 y PACÍFICO FL-15 de11). La bacteria se presentó con mayor prevalencia en la variedad Milagro Filipino, la cual es una de las variedades más extensivamente cultivadas en diferentes regiones del país. En esta investigación se reporta, por primera vez, la presencia de B. glumae en México en semillas de arroz con síntomas de manchado de glumas. Estos resultados son de gran importancia para el desarrollo de investigaciones futuras enfocadas en el establecimiento de estrategias de contención y manejo, y en el mejoramiento genético de variedades de arroz cultivadas en México con resistencia a B. glumae.