Inoculación de Uromyces viciae-fabae en condiciones controladas

Introducción

En el desarrollo de la enfermedad es necesario identificar factores y condiciones óptimas, como la temperatura óptima para la inoculación, método de inoculación, concentración de inóculo, humedad relativa, viabilidad de las esporas o propágulos, condiciones de luz, entre otros. Estos factores son importantes en hongos biótrofos (Lorrain et al., 2019), con la finalidad de realizar cualquier estudio sobre la interacción planta-patógeno (Porras et al., 2023; Dixit et al., 2023; Lahlali et al., 2024).

Caso particular del fitopatógeno Uromyces viciae-fabae causante de la roya del haba, es de gran importancia a nivel mundial. Se caracteriza por formar urediniosporas durante el cultivo y teliosporas en invierno o en la senescencia de la planta. En México no se ha reportado estructuras sexuales del patógeno.

Para la inoculación y replicación de la enfermedad se han adaptado protocolos reportados de otros patosistemas como roya del trigo (Puccinia graminis), avena (Puccinia coronata f. sp. avenae) y cebada (Puccinia hordei) (Ijaz et al., 2021). Desafortunadamente, se desconocen las condiciones óptimas de desarrollo de U. viciae- fabae principalmente: temperaturas de incubación y post-incubación, concentración de inóculo, métodos de inoculación, diluyentes y dispersantes; información de gran utilidad para cualquier estudio de interacción haba-U. viciae-fabae.

Para reproducir la roya del haba diversos investigadores reportan diferentes condiciones. Joseph y Hering (1997) mencionan que las urediniosporas de U. viciae- fabae germinan en un rango entre 5 y 26 °C. Por su parte, Ijaz et al. (2021) indican que la temperatura de desarrollo de la enfermedad es de 22 ± 2 °C. Emeran et al. (2005) mostraron que se pueden inocular plantas de haba con una concentración de 0.5 mg de urediniosporas.

El ácido maleico se emplea para inhibir el crecimiento vegetal en diversos cultivos. En los programas de cereales lo emplean para regular el crecimiento de las plántulas utilizadas para el incremento de inóculo y desarrollo de monopústulares; en trigo se usan

0.8 g L^-1 de ácido maleico (Rodríguez-García et al., 2010). Esto permite tener muchos aislamientos de roya en cámaras pequeñas y no tener contaminación cruzada.

El objetivo de este trabajo fue evaluar temperaturas de incubación y post-incubación, concentraciones de inóculo, efecto del ácido maleico para obtener un método eficiente y reproducible para inocular en genotipos de haba con U. viciae-fabae.

Materiales y Métodos

Material biológico. Se utilizó la línea 5 ICAMEX de haba, la cual es una F6 que se caracteriza por pertenecer a la subespecie mayor, de crecimiento indeterminado desarrollada en el Programa de Mejoramiento Genético de Haba del Instituto de Investigación y Capacitación Agropecuaria, Acuícola y Forestal del Estado de México (ICAMEX). El aislado del hongo fue el genotipo CP21 colectado en 2021 en el Campo Experimental Montecillo del Colegio de Postgraduados ubicado a 19° 27' 38” LN y 98° 54' 11” LO a una altitud de 2250 msnm. La purificación se realizó en 2023, y se obtuvo mediante tres generaciones de cultivos monopústulares en la línea 5 ICAMEX, se conservó en tubos de ensaye de 5 mL a -20 °C. Para reactivar las urediniosporas se aplicó un choque térmico, se inocularon en plantas de haba y se colectaron urediniosporas con las cuales se inocularon los experimentos. Los experimentos se realizaron en el Laboratorio Nacional de Royas y Otras Enfermedades de Cereales (LANAREC) del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP), Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX), ubicado a 19° 29’ 88” LN y 98° 54’ 22” LO y una altitud de 2260 msnm en 2023. La cepa CP21 se ha evaluado en campo en estudios previos y se comportó con mayor virulencia en comparación a otras cepas.

Temperaturas de incubación. Sembraron 40 semillas en vasos de unicel con capacidad de 295 mL en invernadero a 18 ± 2 °C. Las plantas de haba fueron regadas con agua potable durante todo el experimento. Las plántulas se fertilizaron a partir del estadio 10 (son visibles el primer par de hojas) con el fertilizante Haifa^® Poly-Feed a una concentración de 10 g L^-1. Un total de 20 plántulas de haba en estado de desarrollo 13 (tres hojas abiertas), se inocularon mediante aspersión (López-Rodríguez, 2014). La concentración de inóculo fue de 1 × 10⁶ urediniosporas mL^-1 diluidas en 5 mL de aceite mineral Sotrol^® 170 determinada por conteos con una cámara de Neubauer. La inoculación se hizo con un aspersor adaptado a una bomba de vacío de la marca FELISA^® modelo 1500 a una presión de 98066.5 Pa. Una vez inoculadas, 10 de las plántulas se transfirieron a una cámara bioclimática con temperatura de 7 ± 2 °C y las otras 10 plantas a una cámara bioclimática con temperatura de 18 ± 2 °C. Todas las plántulas estuvieron bajo luz continua y 100 % de humedad relativa durante 24 horas. Transcurrido el tiempo de incubación, todas las plántulas se trasladaron a un invernadero con temperatura de 18

± 2 °C.

Concentración de urediniosporas. En este experimento se utilizó el mismo material biológico del hospedante y patógeno, descritos previamente; así como el riego y fertilización. 20 plántulas de haba se inocularon mediante aspersión de 10 días después de la germinación con dos suspensiones de esporas diluidas en aceite mineral Sotrol 170^®. La mitad de las plántulas se inoculó con una suspensión de 1 × 10⁶ urediniosporas mL^-1 y la otra mitad con una suspensión de 3 × 10⁶ urediniosporas mL^-1. La técnica para inoculación se realizó como se describió anteriormente en el experimento temperaturas de incubación. Una vez inoculadas, todas las plántulas fueron colocadas dentro de una cámara bioclimática con temperatura de 18 ± 2 °C, luz continua y 100 % de humedad relativa durante 24 h, la cual fue determinada previamente en el experimento de temperaturas de incubación. Posteriormente, las plántulas se trasladaron a un invernadero con temperatura de 18 ± 2 °C.

Temperatura post-incubación. En este ensayo los componentes biológicos tanto del hospedante como del hongo y el manejo fueron los mismos a los descritos con anterioridad. Se inocularon mediante aspersión, 40 plántulas de haba de 10 días después de la germinación con una suspensión de 3 × 10⁶ urediniosporas mL^-1 diluidas en 5 mL aceite mineral Sotrol 170^®.

Una vez inoculadas, las plántulas se transfirieron a una cámara bioclimática con temperatura de 18 ± 2 °C, luz continua y 100 % de humedad relativa durante 24 h. Concluido el periodo de incubación de 24 h, las plántulas se dividieron en cuatro grupos de 10 plántulas. Dos grupos se colocaron en dos invernaderos con temperatura controlada; un grupo a 18 °C ± 2 °C y el otro grupo a 22 °C ± 2 °C. Los dos grupos restantes estuvieron en dos invernaderos con temperaturas no controladas; uno estuvo a una temperatura promedio de 20 °C, una mínima de 10 °C y máxima de 35 ºC, el otro grupo estuvo a una temperatura promedio de 24 °C, con mínima de 10 ºC y máxima de 42 ºC.

Concentración de ácido maleico. Sesenta semillas de haba de la línea 5 ICAMEX, se sembraron en vasos de unicel con capacidad de 295 mL bajo condiciones de invernadero. El sustrato utilizado fue turba marca Promix^®. Un día después de la germinación estadío 06 (emergencia, el brote traspasa la superficie del suelo) (López-Rodríguez, 2014), se les aplicó 50 mL de ácido maleico marca Sigma-Aldrich^® M0375 diluido en agua destilada, a 20 plántulas a una concentración de 0.3 g L^-1. A otras 20 se les aplicó la misma cantidad de solución, a una concentración de 0.9 g L^-1. Las 20 plántulas restantes sirvieron como testigo, las cuales sólo fueron asperjadas con agua destilada. En total se tuvieron tres tratamientos incluyendo el testigo. Los siguientes riegos hasta la evaluación fueron con agua potable. Las plántulas fueron inoculadas, y sometidas a una temperatura de incubación y post-incubación de 18 °C, temperatura determinada en el experimento anterior.

Variables evaluadas. Transcurridos 15 días desde la inoculación, en cada experimento se realizó la evaluación de tipo de infección (TI) usando la escala de Stakman et al. (1962) adaptada a haba por Sillero et al. (2000), número de pústulas, porcentaje de severidad (Fragoso-Benhumea et al. 2022) y tamaño de pústulas en tres hojas de la parte central de la planta. El período de latencia (PL), se monitoreó desde los 10 días después de la inoculación y; evaluó el PL1, PL50 y PL100, refiriéndose a cuando errumpió la primera pústula, el 50 % de pústulas errumpentes y el 100 % de pústulas errumpentes, respectivamente. El PL 50 se estimó mediante la fórmula propuesta por Niks et al. (2014).

LP50 =a + (b/c) * d

a = Tiempo desde la inoculación hasta el último conteo antes de que el 50 % de las pústulas maduraran.

b = Tiempo entre conteos antes y después de que el 50 % de las pústulas maduraran.

c = Incremento en el número de pústulas durante el periodo b.

d = Conteo al 50 % menos el número de pústulas al comienzo del periodo b.

Sólo para el experimento de concentración de ácido maleico, adicionalmente se midió la altura de planta a los siete y 28 días después de la aplicación. Cada factor se evaluó de forma independiente bajo un diseño completamente al azar con 10 repeticiones, donde una plántula fue la unidad experimental. Todos los experimentos se repitieron dos veces. Se realizó un análisis de varianza y la comparación de medias con la prueba de Tukey (p

≤0.05) utilizando el programa estadístico SAS 9.4.

Inoculación de Uromyces viciae-fabae en invernadero. Para determinar un método óptimo estable, confiable y replicable se tomaron las mejores condiciones previamente determinadas y se comprobó al evaluar el nivel de resistencia a U. viciae-fabae en 13 genotipos de haba procedentes de los programas de Mejoramiento Genético de ICAMEX y Colegio de Postgraduados. El método fue realizado de la siguiente forma: Las semillas de cada genotipo se sembraron en vasos de unicel con capacidad de 295 mL. El sustrato utilizado fue turba marca Promix^®. El experimento se realizó bajo un diseño completamente al azar con 10 repeticiones. Se utilizó una planta como unidad experimental. El experimento se repitió dos veces sin aplicar ácido maleico.

A los ocho días después de la siembra se inocularon con urediniosporas frescas del aislado CP21 de U. viciae-fabae a una concentración de 3 × 10⁶ urediniosporas mL^-1. Se utilizó 5 mL aceite mineral (Sotrol^® 170) como vehículo diluyente. La inoculación se hizo con un aspersor adaptado a una bomba de vacío de la marca FELISA^® modelo 1500. Las plántulas inoculadas se transfirieron a una cámara bioclimática con temperatura de 18 ± 2 °C, luz continua y 100 % de humedad relativa durante 24 h. Después de las 24 h, las plántulas se trasladaron a un invernadero con temperatura de 18 ± 2 °C.

A los 20 días después de la inoculación se evaluó las variables: tipo de infección (TI) utilizando la escala propuesta por Stakman et al. (1962) adaptada a haba por Sillero et al. (2000), (Cuadro 1) número de pústulas, porcentaje de severidad (Fragoso-Benhumea et al., 2022), tamaño de pústulas en tres hojas de la parte central de la planta. El tamaño de pústulas se midió con un vernier de la marca RexQualis. El período de latencia (PL) se monitoreó desde los 10 días después de la inoculación, considerando PL1, PL50 y PL100. El PL50 se estimó mediante la fórmula descrita por Niks et al. (2014). Se realizó un análisis de varianza y la comparación de medias con la prueba de Tukey (p ≤0.05) utilizando el programa estadístico SAS 9.4, con el procedimiento PROC SORT para generar una sola salida del análisis de varianza y comparación de medias de los dos experimentos.

Resultados y Discusión

Temperaturas de incubación. La comparación del efecto de dos temperaturas de incubación permitió conocer el comportamiento en la infección en términos de tipo de infección (TI), número y tamaño de pústulas, porcentaje de severidad y período de latencia (PL) (Zadoks y Schein, 1979).

Los resultados mostraron que ninguna de estas variables (TI, número y tamaño de pústulas, porcentaje de severidad y PL) fue afectada significativamente por las dos temperaturas de incubación (Figura 1A). En este sentido Joseph y Hering (1997) mencionan que las urediniosporas de U. viciae-fabae germinan en un rango entre 5 y 26

°C, siendo 20 °C la temperatura óptima de germinación. Esto coincidió con los resultados obtenidos, pues el aislado evaluado desarrolló la enfermedad a temperaturas de 7 y 18 °C. Por su parte Sillero y Rubiales (2002) también lograron el desarrollo de la enfermedad inoculando plantas e incubando a 20 °C en completa oscuridad y 100 % de humedad relativa durante 24 h. En el genotipo de haba VF-176 presentó un tipo de infección 4 según la escala de Stakman et al. (1962) adaptada a haba por Sillero et al. (2000). Además, detectaron variación en el nivel de resistencia entre genotipos debido a que en el genotipo V-300 se observó un tipo de infección 2. También encontraron que el PL100 (periodo de latencia), cuando todas las pústulas esporularon, fue a los 10 días después de la inoculación, siendo notablemente que los periodos de latencia son más cortos que los obtenidos en el presente estudio; esto pudiera deberse a una interacción genética entre los genotipos tanto del patógeno como del hospedante que son distintos con los nuestros. El número de pústulas obtenidas a los 7 °C fueron 3.6 mientras que a los 18 °C se obtuvieron 3.8.

En virtud de que en ambas temperaturas de incubación se desarrolla U. vicia-fabae, es factible utilizar una temperatura de 18 °C puesto que para lograr temperaturas de 7 °C se requiere de sistemas frigoríficos que elevan los costos.

Concentración de urediniosporas. La concentración de urediniosporas de 3 x 10⁶ mostró diferencias significativas (p <0.0001) en las variables de número de pústulas y severidad, con respecto a la concentración 1 x 10⁶, pero sin afectar los períodos de latencia, el PL1 fue de 12 días (d), PL50 13 d y PL100 13.6 d. Tampoco afectó tipo de infección y tamaño de la infección (Figura 1B). Emeran et al. (2005) mencionaron que plantas de haba de los genotipos Amcor y Baraca inoculadas con una concentración de

0.5 mg de esporas por planta mostraron un TI 4 en ambos genotipos, con severidad de 25 y 30 %, respectivamente. Ijaz et al. (2021) indicaron que la concentración de inóculo no afecta el tipo de infección, pero si puede influir en el número de pústulas y por ende en el porcentaje de severidad. Resultado similar se obtuvo en esta investigación y se ilustra en la Figura 1B.

Temperatura post-incubación. En el Cuadro 2 y Figura 2 se muestra el efecto de la temperatura de la post-incubación. Para el ambiente no controlado de 24 °C en promedio no se observaron síntomas; esto pudo deberse a que, en determinadas horas del día, la temperatura máxima alcanzó los 42 °C afectando el desarrollo del patógeno. U. viciae- fabae fue capaz de desarrollarse en temperaturas controladas de 18, 22 °C y en temperaturas no controladas donde el promedio de temperatura fue 20 °C con mínima de 10 °C y máxima de 35 ° C. Es notable que, a temperatura de 18 °C los PLs 1, 50 y 100, se prolongan respecto a las otras dos temperaturas evaluadas, las cuales entre ellas tuvieron un comportamiento similar. Se observó un PL de 14 a 16 d desde la inoculación hasta la esporulación en temperaturas controladas de 18 y 22 °C, así como en temperatura no controlada de 20 °C promedio.

La temperatura post-incubación juega un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. En haba se ha reportado que las temperaturas de desarrollo de U. viciae fabae son 22 ± 2 °C (Ijaz et al., 2021) y 20 °C (Ijaz et al., 2020) denotando que los períodos de latencia variaron de acuerdo con el aislado del patógeno y el hospedante utilizado. Por otro lado, Ijaz et al. (2020) inocularon dos aislados denominados 4 y 8, procedentes de Australia sobre el cultivar susceptible Fiord y sobre el cultivar resistente Ac1655, en el primero ambos aislamientos mostraron un TI 3+ mientras que el segundo, que posee el gen mayor Uvf-3 de resistencia incompleta tuvo un TI 12C según la escala de Ijaz et al. (2018) que va de 0 a 4, lo que significa una menor compatibilidad entre genotipos del patógeno y hospedante, dando evidencia del efecto del gen mayor para resistencia incompleta. Los datos de este estudio muestran que, en temperaturas de 18 °C, el número de pústulas y la severidad son altos, pero cuando la temperatura se incrementa el número de pústulas y severidad tienden a reducirse hasta cero (Figura 2). Este comportamiento indica que la severidad es influenciada por la temperatura, ya que la severidad sólo puede calcularse con base en el número de pústulas. Las temperaturas de 20 y 22 °C tienen un comportamiento similar, pero con diferencias con las obtenidas a 18 °C en la mayoría de las variables.

Concentración de ácido maleico. Las dos concentraciones de ácido maleico afectaron el crecimiento de las plántulas de haba. La concentración de 0.3 g L^-1 afectó la altura promedio a los 7 y 28 días, con respecto al testigo en 3 y 40 cm, respectivamente. El efecto fue mayor en la concentración de 0.9 g L^-1 pues el crecimiento obtenido a los 7 y 28 días fue 7 y 48 cm menor, respectivamente comparadas con el testigo (Figura 3 y Cuadro 3).

Los resultados obtenidos muestran que a mayor concentración de ácido maleico la altura de la plántula será menor. Un efecto observado fue que el ácido maleico además de afectar la altura de la planta también afectó el desarrollo de la enfermedad puesto que sólo el 50 % de las plántulas tratadas con una concentración de 0.9 g L^-1 presentaron esporulación; además, permitió un número y tamaño de pústulas menor comparado con el testigo y con las plantas tratadas con una concentración de 0.3 g L^-1. La concentración de 0.9 g L^-1 de ácido maleico afectó los períodos de latencia 1, 50 y 100 al prolongar hasta 4 días la esporulación de las pústulas comparadas con el testigo y con la concentración de 0.3 g L^-1. Esta observación puede ser útil en caso de que se requiera una esporulación tardía.

Aunque hay pocos estudios de cómo actúa el ácido maleico en los tejidos y células de la planta una posible explicación de los resultados anteriores es debido a que el ácido maleico actúa como inhibidor de la auxina (Zhu et al., 2021). Zhu et al. (2021) aplicaron ácido maleico a Spirodela polyrrhiza y encontraron que afecta negativamente la expresión de 14 genes relacionados con la auxina, la cual es encarga de promover el crecimiento vegetativo de las plantas.

El ácido maleico se ha estudiado para el control de hongos. Fei et al. (2023) lo evaluaron como agente de control in vitro y en hojas desprendidas de Brassica napus, encontraron una reducción en la severidad de Sclerotinia sclerotiorum. Debido a que la secreción de ácido oxálico (asociado con la colonización de los hongos), se reduce por efecto del ácido maleico. Causando una baja expresión de genes relacionados con la virulencia del hongo (SS-Bil y SS-Ggt1).

Esto también pudieran estar sucediendo en la concentración 0.9 g L^-1 de ácido maleico aplicado en plantas de haba, pero se requiere de estudios que permitan comprender los modos de acción del ácido maleico.

El ácido maleico se ha empleado como regulador de crecimiento vegetal y como herbicida. En diversas especies se ha utilizado como inhibidor de crecimiento como en papa (Solanum tuberosum), en otras se ha probado que suprime el crecimiento en caléndula (Calendula officinalis), trigo (Triticum aestivum), cebolla (Allium cepa), ajo (Allium sativum), árboles forestales, frutales y ornamentales, así como inhibir la germinación de plantas holoparásitas y malezas (Karki et al., 2021; Venezian et al., 2017).

Con base en los resultados obtenidos, la aplicación de una concentración de 0.3 g L^-1, puede ser recomendada para tener una plántula de aproximadamente 20 cm, facilitando el incremento de inóculo y la obtención de cultivos monopústulares, pues una altura de estas dimensiones o menor permite tener un manejo adecuado de la planta, una mayor cantidad de inóculo en espacios reducidos y evitar contaminación cruzada de los aislamientos de roya. Esto permite tener inóculo puro para diversos estudios, como la evaluación de la resistencia genética, diversidad del patógeno, en agresividad o virulencia, evaluación de la efectividad biológica de fungicidas, proceso de patogénesis. En trigo, cebada y avena se emplea el ácido maleico para incrementar el inóculo de las diferentes royas que enferman a estos cultivos. Para el caso de roya amarilla (Puccinia striiformis f. sp. tritici) del trigo, en México, se aplica una dosis de 0.8 g L^-1 de ácido maleico para regular su crecimiento (Rodríguez-García et al., 2010). El ácido maleico suprime el crecimiento de las plántulas y la hoja primaria se desarrolla al máximo (Samborski et al., 1960), por lo que la producción de esporas es muy abundante (Knott, 1989) lo que coincide con lo observado en la dosis 0.3 g L^-1 donde las plantas fueron de menor tamaño que las obtenidas en el testigo, sin afectar el tamaño de pústula. Sin embargo, la aplicación de ácido maleico no es recomendable en experimentos para evaluación de la resistencia.

Las evidencias encontradas fortalecen el propósito en programas de mejoramiento genético para resistencia a royas, permite tener eficiencia y eficacia en los resultados por la uniformidad genética de los monopústulares (McIntosh et al.,1995).

Inoculación de Uromyces viciae-fabae en invernadero. La intención fue conocer el nivel de resistencia a U. viciae-fabae bajo condiciones controladas validando el método de inoculación que consiste en una concentración de inóculo de 3 × 10⁶ urediniosporas por mL^-1 en aceite Soltrol^®, una temperatura de incubación de 18 °C, humedad relativa de 100 % durante 24 h y una temperatura post-incubación de 18 °C (Cuadro 4), estas condiciones permitieron evaluar eficientemente los principales componentes del monociclo como período de latencia, número y tamaño de pústulas y porcentaje de severidad. También permitió estimar el tipo de infección que nos indica el grado de compatibilidad entre el hospedante y patógeno, máximo signo del tipo de resistencia que se está manifestando (Ijaz et al., 2021).

Los resultados sugieren que el método es estable y reproducible, siendo una herramienta útil para hacer evaluaciones en plántulas para conocer las diferentes interacciones que se dan en este patosistema, así como detectar fuentes de resistencia, diversidad del patógeno y su hospedante, la variabilidad patogénica, la determinación de diferenciales para la identificación de razas fisiológicas entre otros estudios, ya que la expresión fenotípica de la interacción del hospedante y el patógeno será altamente confiable.

En los patosistemas más estudiados que involucran una roya, como son diversos cereales y leguminosas, se han caracterizado principalmente dos tipos de resistencia, la resistencia de hipersensibilidad dada por pocos genes que indica poca o nula compatibilidad entre el patógeno y el hospedante, los tipos de infección bajos es considerado como un fenotipo resistente, dependiendo de la escala utilizada, en haba se tiene un comportamiento similar (Ijaz et al., 2018; Rubiales y Khazaei, 2022; Adhikari et al., 2025). Los tipos de infección altos indican mayor compatibilidad entre hospedante y patógeno que se considera un fenotipo susceptible. Esta variable es la más importante cuando se trata de la evaluación de la resistencia, pues nos indica que tipo de material que se tiene en el programa de mejoramiento y el camino a seguir en el proceso (Ijaz et al., 2021). El otro tipo de resistencia es la horizontal o poligénica aunque es menos estudiada que la antes mencionada, ha sido reportada por diversos autores (Sillero et al., 2000; Rubiales y Khazaei, 2022).

En este estudio las condiciones de inoculación, incubación y post-incubación, previamente descritas (Cuadro 3 y Figura 4), permitieron realizar eficientemente la evaluación de la resistencia de los 13 genotipos utilizados, pues los TI fueron claros y consistentes, indicando que el germoplasma evaluado tiende más hacia susceptibilidad, pues los valores de TI 3 indican mayor compatibilidad entre patógeno y hospedante.

Debido a que no se contaba con un método claro para evaluar la resistencia a U. vicia- fabae en México, se utilizó la línea 5 ICAMEX, la cual se ha reportado como susceptible, pero ahora con datos contundentes y el análisis multivariado. Se puede recomendar utilizar el genotipo Zacatelco 1, ya que es mayormente susceptible que 5 ICAMEX. Huahuaxtla 1, según el análisis multivariado es el de mayor nivel de resistencia. Estudios más detallados y con suficientes repeticiones serán necesarios para caracterizar con mayor precisión estos genotipos y darles el uso adecuado en los programas de mejoramiento, así como estudios de herencia de la resistencia.

Conclusiones

El método de inoculación para reproducir eficientemente a U. viciae-fabae bajo condiciones controladas, consiste en asperjar una concentración de esporas de 3 × 10⁶ urediniosporas mL^-1 de aceite Soltrol. La incubación debe hacerse a 18 °C y humedad relativa del 100 %. La temperatura de post-incubación debe ser de 18 °C. La evaluación de la resistencia de los genotipos de haba a roya permitió validar el método de inoculación, siendo confiable, estable y reproducible. Una concentración de ácido maleico de 0.3 g L^-1 permite tener plántulas pequeñas para generación de cultivos monopustulares. El Método de inoculación se puede utilizar para estudios del patógeno como del hospedante y la resistencia genética a U. viciae-fabae.