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Clonación, expresión y detección serológica de la putativa ARN polimerasa del Virus de la meleira de la papaya variante mexicana en Escherichia coli
por Wendy Serra, Jeanin A Arguelles Quintal, Mildred Carrillo Pech, Alethia F Toriz , Enrique Castaño, Ignacio Islas Flores, Luisa A Lopez Ochoa*
*Autor de Correspondencia.
Recibido: 01/mayo/2024 – Publicado:
30/abril/2025
DOI:
https://doi.org/10.18781/R.MEX.FIT.2405-00
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Resumen Antecedentes/Objetivo. La enfermedad de la meleira en papaya en México está asociada al Virus de la meleira de la papaya variante mexicana (PMeV-Mx) y se caracteriza por la exudación espontánea de látex en los frutos. El ORF2 de PMeV-Mx codifica una proteína que tiene motivos de ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp) la cual es esencial para la replicación viral. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método para la producción y purificación de la proteína recombinante codificada por el ORF2 de PMeV-Mx (pORF2) en Escherichia coli y generar anticuerpos específicos para su detección.
Materiales y Métodos. El genoma de PMeV-Mx se analizó utilizando UGENE para predecir los ORFs e identificar el posible sitio deslizante. Se utilizaron plantas de papaya inoculadas con látex de frutos de plantas sintomáticas como reservorio del virus, la infección por PMeV-Mx se confirmó mediante RT-PCR. El ORF1 y ORF2 se amplificaron por PCR a partir de ADNc de papayas infectadas. Ambos se clonaron en el vector pGEM-T Easy y se transfirieron a pDONR221 y pDEST17 para su expresión en E. coli. La proteína recombinante 6xHis-pORF2 se expresó en la cepa BL21 de E. coli y se purificó bajo condiciones desnaturalizantes. La proteína purificada se utilizó para generar anticuerpos policlonales. La especificidad del antisuero y sus diluciones óptimas de trabajo se evaluaron mediante ensayos de inmunodetección, utilizando la proteína recombinante como diana y proteínas etiquetadas con His como controles negativos.
Resultados. Se logró la expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx. Se detectó una banda de aproximadamente ~46,5 kDa, consistente con su peso molecular estimado. La expresión de la proteína se observó entre 2 y 6 horas después de la inducción. El análisis por western blot confirmó la presencia de la etiqueta de Histidinas y la integridad de la proteína recombinante. La purificación con resina Ni-NTA resultó en una banda intensa de ~46,5 kDa, junto con bandas menores de 15 a 150 kDa. Se generaron anticuerpos policlonales contra pORF2, los cuales reconocieron específicamente la proteína purificada en los ensayos de inmunodetección, con detección en diluciones de 1:500 a 1:3000. No se observó reactividad cruzada con los controles negativos, aunque se detectó una banda inespecífica de ~75 kDa en extractos de E. coli.
Conclusión. Se estableció un protocolo para la expresión, detección y purificación de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx en E. coli. Los anticuerpos policlonales generados en conejo reconocieron la proteína de interés en extractos proteicos de células bacterianas, aunque se requiere una mayor optimización para mejorar la especificidad. Estos anticuerpos contribuirán al desarrollo futuro de herramientas de diagnóstico y a la caracterización de la proteína en plantas.
Palabras clave: Meleira de la papaya, proteína recombinante, anticuerpos, virus similares a umbravirus, PMeV-Mx.
Cuadro 1. Cebadores utilizados para la obtención de los plásmidos pCB252 Y pCB253, mediante la clonación del ORF1 Y ORF2 de PMeV-Mx en el vector pDEST17.
Figura 1. Frutos en plantas de papaya (Carica papaya) variedad Maradol cultivadas en casa sombra. A) Frutos de papayas que fueron inoculadas con látex de PMeV-Mx, mostrando los síntomas característicos de la enfermedad de la meleira, con exudación espontánea de látex. B) Frutos de plantas sanas de papaya, inoculadas solo con el amortiguador.
Figura 2. Organización genómica de PMeV-Mx. Los números indican la posición en nucleótidos (nt) y la cantidad total de nt en el genoma parcial. Los cuadros en el genoma representan el ORF1 y el ORF2, respectivamente. Los cuadros debajo representan los productos putativos del ORF1 y ORF2 (pORF1 y pORF2, respectivamente), así como el producto de fusión putativo que se podría obtener a partir de desplazamiento ribosomal en -1 nt (pORF1/pORF2). La flecha indica la posición de la secuencia deslizante.
Figura 3. Ensayo de expresión temporal de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx empleando la fracción proteica correspondiente a los cuerpos de inclusión de E. coli. La expresión de 6xHis-pORF2 se indujo con 1 mM IPTG a 37 °C. Se retiraron alícuotas en los tiempos indicados (1 a 6 h después de la inducción con IPTG) y las proteínas se visualizaron mediante gel SDS teñido con Coomassie. M, marcador Bio-Rad 10-250 kDa; NI, control no inducido. La flecha indica la proteína 6xHis-pORF2 de 46,5 kDa.
Figura 4. Detección de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx en extractos proteicos de E. coli empleando el anticuerpo monoclonal anti-His. A) Gel de SDS teñido con Coomassie. B) Western blot en membranas de PVDF incubadas con una dilución 1:1000 del anticuerpo monoclonal anti-His acoplado a peroxidasa de rábano (HRP). M, marcador Bio-Rad 10-250 kDa; NI y 6xHis-GST-8xHis, control no inducido y positivo, respectivamente; 6xHis-pORF2, fracción celular con la proteína recombinante pORF2 de PMeV-Mx expresada en células BL21. Las flechas indican las proteínas 6xHis-pORF2 (~46,5 kDa) y 6xHis-GST-8xHis (~28 kDa), respectivamente.
Figura 5. Purificación de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx con resina de Ni-NTA en condiciones desnaturalizantes. M, marcador Bio-Rad 10-250 kDa; I, input; Ft, flow-through; E1 y E2: primera y segunda elución, respectivamente; R, resina. La flecha indica la proteína 6xHis pORF2 (~46,5 kDa).
Figura 6. Detección de la proteína recombinante 6xHis-pORF2 de PMeV-Mx en extractos proteicos de E. coli empleando el anticuerpo policlonal anti-RdRp. A) Gel de SDS teñido con Coomassie. B) Western blot en membrana de Nitrocelulosa, incubada con el anticuerpo policlonal anti-RdRp de PMeV-Mx (dilución 1:1000) y el anticuerpo secundario anti-conejo acoplado a peroxidasa de rábano (HRP) (dilución 1:3000). M, marcador Bio-Rad 10-250 kDa; NI, fracción celular no inducida. 6xHis-pORF1 y 6xHis-GST-8xHis controles negativos. La flecha indica la proteína 6xHis-pORF2 (~46,5 kDa).
